Reaktion von UDP‐Apiose/UDP‐Xylose‐Synthase mit isotopenmarkierten Substraten: Hinweise auf einen Mechanismus mit gekoppelter Oxidation und Aldolspaltung

Abstract

Der C-verzweigte Zucker d-Apiose (Api)i st essenziell fürdie Entwicklung der pflanzlichen Zellwand. Eine enzymkatalysierte Decarboxylierungs-Pyranosidringkontraktions-Reaktion führt von UDP-a-d-Glucuronsäure (UDPGlcA) zur Api-Vorstufe UDP-a-d-Apiose (UDP-Api). Der Mechanismus von UDP-Api/UDP-a-d-Xylose-Synthase (UAXS) wurdem ittels ortsspezifisch 2 H-markierter sowie desoxygenierter Substrate untersucht. Aus dem Analogon UDP-2-Desoxy-GlcA, das die C-2/C-3-Aldolspaltung als den wahrscheinlichen Schritt zur Einleitung der Pyranosid-zuFuranosid-Umwandlung verhindert, bildete sich kein entsprechendes Api-Produkt. Die kinetischen Isotopeneffekte stützen einen UAXS-Mechanismus,i nd em die Substratoxidation durch Enzym-NAD + und die Retroaldol-Zuckerringçffnung gekoppelt in einem einzelnen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt auftreten, der zur Decarboxylierung führt. Eine Neuanordnung und ringkontrahierende Aldoladdition in einem offenkettigen Zwischenprodukt ergeben dann UDP-Api-Aldehyd, der durch Enzym-NADH reduziert wird.[1] Verbindung 2 kommt in den Zellwandpolysacchariden Rhamnogalacturonan II und Apiogalacturonan sowie in verschiedenen pflanzlichen Sekundär-metaboliten vor.[1-4] Zuckernukleotid 1 entsteht aus UDP-a-[5]Der vorgeschlagene Mechanismus dieser chemisch sehr interessanten Biotransformation (Schema 1) umfasst eine NicotinamidAdenin-Dinukleotid(NAD + )-unterstützte Oxidation an C-4 von Substrat 3,gefolgt von einer Decarboxylierung zu UDPb-l-threo-Pentopyranosid-4-ulose (4). [5][6][7] Die Neuanordnung des Kohlenstoffgerüsts (4!5!6)e rfolgt danach wahrscheinlich über eine Retroaldol-Aldol-Reaktion, [6] und die Reduktion von UDP-a-d-Apiose-3'-aldehyd (6)d urch Enzym-NADH ergibt 1.[ [5][6][7] Das alternative Reaktionsprodukt, UDP-a-d-Xylose (7), entsteht aus 4,e benfalls durch eine NADH-abhängige Reduktion. UDP-a-d-Xylose-Synthase (UXS) ist strukturell und mechanistisch mit UAXS verwandt, hat aber nicht die Fähigkeit, die Pyranosid-zu-Furanosid-Umwandlung zu katalysieren.[8] Die vorgeschlagenen Reaktionspfade von UAXS und UXS trennen sich daher wahrscheinlich an Intermediat 4.Ungeachtet seiner weitverbreiteten Akzeptanz in der Literatur [5][6][7] wirft der Mechanismus aus Schema 1F ragen auf, da er voraussetzt, dass UAXS 4 gleichwertig sowohl füre ine Aldol-Ringspaltung als auch füre ine Reduktion durch NADH erkennt. Wied as Enzym zwischen diesen beiden Mçglichkeiten unterscheidet, ist unklar.Zusätzlich gibt es nur indirekte Belege fürd ie Retroaldol-Aldol-Route bei der Umsetzung von 4 zu 6.Ein 2-Desoxy-2-fluor-Analogon von 3, das die C-2/C-3-Aldolspaltung in einer entsprechenden 2-Fluor-Variante von 4 unmçglich macht, war mit UAXS vçllig unreaktiv.[6a] Ein chemisch stabiles Phosphonatanalogon von 1 (1a;S chema 1) wurde von UAXS zur entsprechenden Xylosylverbindung umgesetzt, und es bildete sich ein cyclisches Xylosephosphonat (7b)a nstelle des erwarteten Produkts 7a (Schema 1). Die Beteiligung einer enzymatisch deprotonierten Hydroxygruppe an C-2, die auch in der "nativen" Retroaldol-Umsetzung vo...