Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Abstract

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAClabeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

Proteome Heterogeneity in Colorectal Cancer

“…One must be cautious with using patient‐derived xenograft (PDX) models, as it failed to capture the complete tumor heterogeneity in the original tumor from the patient . To enrich specific tumor cells subpopulations, multiple attempts, including laser capture microdissection and flow cytometer, have been used to decipher ITH in both the solid and liquid tumors, respectively . Bramsen and colleagues have reported stroma from the spatially distinct regions of tumor affected the CRC tumor subtype assignment .…”

Towards Discovery and Targeted Peptide Biomarker Detection Using nanoESI-TIMS-TOF MS

“…For example, current bottom-up proteomic strategies require the chemical treatment of samples ( i.e. , trituration, protein extraction, enzymatic digest) prior to analysis which result in highly complex mixtures which then require further separation and preparation prior to MS analysis [7].…”

Proteomische Analyse von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs und Plattenepithelkarzinomen der Lunge

“…Dabei wird SDS in einem Zentrifugalfilter durch Urea ausgetauscht, die Proteine werden proteolytisch verdaut und die dabei entstehenden Peptide isoliert, welche dann der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden können (Wiśniewski et al 2009b). In diversen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese Methode zur Proteomanalyse geeignet ist und mehrere Tausend Proteine in einem einzigen MS/MS-Durchlauf identifiziert und quantifiziert werden können (Wiśniewski et al 2009a;2010;Ostasiewicz et al 2010;Wiśniewski 2013;Erde et al 2014;Bohnenberger et al 2015). Der Einsatz von FASP, insbesondere in der Kombination mit einem Proteinquantifizierungsstandard wie auch in dieser Studie angewendet, stellt einen leistungsfähigen Ansatz zur Identifikation von Biomarkern und proteomischen Signaturen zur Charakterisierung maligner Neoplasien dar (Wiśniewski et al 2011;Deeb et al 2012;Zhang et al 2014;Bohnenberger et al 2015) und ist damit gut geeignet, die klinisch dringend benötigten Biomarker zur Unterscheidung von metHNSCC und SQCLC zu identifizieren.…”

“…Vor der Analyse der Tumorgewebeproben wurde der Zusammenhang zwischen dem aus den Studien an anderen humanen Geweben, bei denen in einem einzelnen massenspektrometrischen Durchlauf ebenfalls mehrere Tausend Proteine identifiziert und quantifiziert werden konnten (Wiśniewski et al 2011;Deeb et al 2012;Bohnenberger et al 2015). Tumorentitäten anhand des loss of heterozygosity, TP53-Mutationstatus, copy number alterations, DNA-Methylierung oder der Genexpression untersucht (Geurts et al 2005;Talbot et al 2005;Vachani et al 2007;Campbell et al 2018;Jurmeister et al 2019).…”

“…(Bandelin electronic, Berlin) sonifiziert und für 15 min bei 20.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nun lagen die Proteine in Lysepuffer gelöst vor (im Folgenden als FFPE-Lysat bezeichnet).2.2.3 Filter-gestützte Probenaufbereitung (FASP)Die Grundlage für die weitere Aufarbeitung der FFPE-Lysate (s. 2.2.2) bildete die bereits zuvor beschriebene Filter-gestützte Probenaufbereitung (filter-aided sample preparation, FASP)(Wiśniewski et al 2009b;Wiśniewski 2013;Bohnenberger et al 2015). Diese diente vor allem dazu, Chemikalien, welche für die Lyse und Solubilisierung verwendet worden waren, jedoch ungeeignet für die Massenspektrometrie sind, beispielsweise SDS, wieder aus den Proben zu entfernen.…”