Purification of protein–DNA complexes by native gel electrophoresis for electron microscopy study

Abstract

Электрофоретическое разделение в нативных условиях может быть использовано для очистки белковых молекул, а также их комплексов с ДНК и другими лигандами. В данной работе этот метод использован для разделения фракций моно-и динуклеосом. Показана принципиальная возможность специфического выделения комплексов ДНК с белком размером около 200 кДа из нативного геля в препаративных количествах для изучения с помощью электронной микроскопии. Получены двумерные проекционные структуры нуклеосом с разрешением 25 Å. Проведено сравнение электронно-микроско-пических изображений нуклеосом до и после выделения из нативного полиакриламид-ного геля. Выявлено, что ориентация нуклеосом на углеродной подложке до и после электрофоретического разделения различна.Ключевые слова: мононуклеосома, динуклеосома, электронная микроскопия, обработка изображений, электрофорез в ПААГ.Ядерная ДНК клеток эукариот находится в комп-лексе с гистоновыми и негистоновыми белками, образуя хроматин. Белки обеспечивают сверхспира-лизацию и компактизацию ДНК, а также процессы репликации, транскрипции, репарации и рекомби-нации. В регуляции этих процессов существенную роль играет структура хроматина, которая зависит от конформационных изменений гистонов, а также хроматин-ремоделирующих факторов [1, 2], обеспе-чивающих доступность тех или иных участков ДНК для ферментов.Основной структурной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из фрагмента ДНК длиной 146 пар нуклеотидов, образующего 1,75 витка, накрученного на октамер гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Гистоновый октамер состоит из центрального тетрамера (Н3-Н4) 2 , окруженного двумя димерами Н2А/Н2В. Пространственная структура нуклеосомы напоминает шайбу или плоский цилиндр диаметром 11 нм и высотой 5,7 нм [3,4].Структурная целостность октамерного комплек-са обеспечивается межмолекулярными взаимодей-ствиями гистонов: два димера Н3-Н4 соединяются благодаря взаимодействию между гистонами Н3. Образованные таким образом тетрамеры (Н3-Н4) 2 связываются с димерами Н2А/Н2В благодаря взаи-модействию между гистонами Н4 и Н2В. Молеку-лярная масса нуклеосомы составляет около 215 кДа. Линкерный участок ДНК между нуклеосомами состоит в среднем из 60 пар нуклеотидов. К этому участку присоединена молекула гистона Н1. Про-цессы перемещения нуклеосом по ДНК, приводя-щие к изменению их плотности, называются ре-моделированием хроматина. Оно может включать изменения в составе гистонового октамера ("об-мен/потеря" гистонов и их модификации). Данные процессы играют существенную роль в контроле экспрессии генов, формировании эпигенетической памяти клетки, регуляции процессов транскрипции и репарации. Особую роль в процессе ремоделиро-вания выполняют N-концевые участки гистонов, наиболее часто подвергающиеся посттрансляцион-ным модификациям. Они практически не структу-рированы и выходят за границу нукеосомы, обес-печивая взаимодействия с ДНК и различными белковыми факторами [5].При АТФ-зависимом ремоделировании хрома-тина могут образовываться динуклеосомы [6]. Пе-рестройки хроматина, сборка и разборка нуклеосом сопровождают ...