Purification and optimization of conditions for DNA polymerase isolated from thermophile bacteria Bacillus caldolyticus

Abstract

Тhermophilic bacteria Bacillus caldolyticus isolated from the hot spring in Bansko, Republic of Macedonia, were used for the isolation of DNA polymerase. Bacterial cells were disrupted by sonication and the first step in the purification of DNA polymerase was 40% ammonium sulfate precipitation. This was followed by chromatographic procedures on Sephadex G-50, DE-52 and CM-52 cellulose. DNA polymerase activity was analyzed at each step of purification using the incorporation of 3 H dATP in activated calf thymus DNA. The purity of the DNA polymerase was analyzed on SDS PAGE. Optimal conditions of activity were determined for temperature, pH, dNTP and Mg ++ concentration. In addition, the effect of ethanol and EDTA as possible inhibitors of polymerase activity was also analyzed. The optimal temperature of DNA polymerase was 66 ºC; the optimal pH was 7.2, optimal MgCl 2 concentration was 2.5 mM, and the optimal substrate concentration was 2.5 × 10 -6 M dNTP. The inhibitory effect of EDTA and ethanol on DNA polymerase was above 10 mM and 10%, respectively. Keywords: Bacillus caldolyticus; DNA polymerase; purification; optimization; inhibitors ПРОЧИСТУВАЊЕ И ОПТИМИЗИРАЊЕ НА УСЛОВИТЕ ЗА ДНК-ПОЛИМЕРАЗА ИЗОЛИРАНА ОД ТЕРМОФИЛНАТА БАКТЕРИЈА BACILLUS CALDOLYTICUSТермофилната бактерија Bacillus caldolyticus изолирана од термалниот извор во Банско, Република Македонија, беше користена за изолација на ДНК-полимераза. Бактериските клетки се лизирани со ултразвук и првиот чекор во прочистувањето на ДНК-полимеразата беше исталожување со 40% амониум сулфат. Потоа следуваа хроматографски процедури на Sephadex G-50, DE-52 и CM-52 целулоза. Активноста на ДНК-полимеразата беше анализирана во секој степен на прочистувањето со инкорпорација на 3 H dATP во активирана ДНК од телешки тимус. Чистотата на ДНК-полимеразата беше анализирана со користење на SDS PAGE. Оптималните услови за активноста беа одредени за температура, pH, dNTP и Mg ++ . Дополнително беа анализирни ефектите на етанолот и EDTA како можни инхибитори на ДНК-полимеразната активност. Оптималната температура за оваа ДНК-полимераза е 66 ºC, оптималната pH е 7.2, оптималната концентрација на MgCl 2 е 2.5 mM, додека оптималната концентрација на dNTP е 2.5 × 10 -6 M. EDTA покажува инхибиторен ефект врз ДНК-полимеразата во концентрација над 10 mM, додека етанолот во концентрација над 10%.

Association of polymorphism κ-casein gene with longevity and lifetime production of Holstein-Friesian cows in Vojvodina

“…After that, 300 ng of DNA were used in 50 µL PCR reactions to yield a 760 bp fragment. PCR reactions were performed as follows: PCR buffer (10 mM TRIS-HCl pH 8.3, 50 mM KCl); 20 pM of each primer; 2.5 mM dNTP; 200 µM MgCl 2 ; 5 U Taq polymerase (Popovski, 1999). PCR steps were: denaturation at 95 °C for 5 min, 3 steps of denaturation at 94 °C for 1 min, hybridization at 65 °C, 1 min and subsequent polymerisation at 72 °C during 2 min, with 35 cycles.…”