Purification and crystallization of bovine liver phosphorylase

Hwang, Peter K.; Stern, Michael D.; Fletterick, Robert J.

doi:10.1016/0167-4838(84)90016-5

Cited by 15 publications

(6 citation statements)

References 28 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Proteins were separated in the PhastSystem using native PhastGel gradient gels with 10(150% acrylamide [34], and blotted on to nitrocellulose sheets by using the Phast- range or somewhat lower compared with that described by others for the enzyme from rat [19,35], or rabbit [16,27] liver. Higher activities were reported for bovine and pig liver phosphorylase [24,27]. Phosphorylase from brain was also obtained in the AMP-dependent form.…”

Section: Electrophoretic Procedures (1) Analytical Isoelectric Focusimentioning

confidence: 99%

“…Cellular debris, nuclei and mitochondria were removed by centrifugation at 6000 g (15 min), and glycogen particles were sedimented at 40000 g (2 h). The glycogen pellet containing most of the phosphorylase protein [24,27] was suspended in buffer A and incubated with 25 ,ug of a-1,4-1,6-amyloglucosidase/ml for 1 h at 30°C, in order to digest the glycogen and to solubilize phosphorylase. During this step, phoshorylase was converted into the b-form.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

See 1 more Smart Citation

Glycogen phosphorylase isoenzymes from hepatoma 3924A and from a non-tumorigenic liver cell line. Comparison with the liver and brain enzymes

Mayer

Seelmann-Eggebert

Letsch

1992

Biochemical Journal

View full text Add to dashboard Cite

Glycogen phosphorylase isoenzymes were isolated from normal rat liver, rat brain, the glycogen-poor Morris hepatoma (MH) 3924A, and the glycogen-rich non-tumorigenic liver cell line C1I. Electrophoretic and immunological characterization of the enzymes showed that tumour and C1I cells expressed a phosphorylase isoform similar to the brain type; the liver type was not detectable. All enzymes were obtained as dimers; the Mr of the subunits was 96000 (liver), 93000 (brain and MH 3924A) and 92000 (C1I). Isoelectric focusing revealed a main band of pI 6.34 for liver phosphorylase a, pl 5.67 for the enzymes from MH 3924A and brain, and pI 5.68 for CII phosphorylase. Partial kinetic characterization of the AMP-independent forms of the isoenzymes yielded Km values for glucose 1-phosphate of 3.5 + 0.5 mm (liver), 3.9 mm (brain), 1.9 + 0.3 mm (MH 3924A) and 2.5 + 0.5 mm (C1I); Km values for glycogen were 0.4 mM (liver) and 0.3 mm (MH 3924A and C1I), calculated as glucose equivalents. The AMP-independent phosphorylase was inhibited by glucose 6-phosphate (Glc6P) with Ki values of 0.32 + 0.03 mm (C1I), 0.50 + 0.04 mm (MH 3924A) and -5 mM (brain). The inhibition could be abolished by 1 mM-AMP, indicating that AMP and Glc6P may partially compete for the same site on the protein. Liver phosphorylase a was not inhibited by up to 25 mM-Glc6P. In contrast with liver and brain isoenzymes, phosphorylase from the cell lines was not affected by NaF and Na2SO4. The data show that both the hepatocellular carcinoma and the non-malignant immortalized liver cells express a phosphorylase isoform different from the liver type. Furthermore, there is some evidence that the enzyme from MH 3924A and C1I cells is distinct from brain phosphorylase a, in spite of electrophoretic and immunological resemblance, and that this isoenzyme is subject to altered metabolic regulation.

show abstract

Section: Electrophoretic Procedures (1) Analytical Isoelectric Focusimentioning

confidence: 99%

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Glycogen phosphorylase isoenzymes from hepatoma 3924A and from a non-tumorigenic liver cell line. Comparison with the liver and brain enzymes

Mayer

Seelmann-Eggebert

Letsch

1992

Biochemical Journal

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…The polypeptide chains associated with these bands are termed M97, F55 and F40. This is the same form of the enzyme as purified by Hwang et al 4, and we have named it phosphorylase b 3. The other form, which is a novel one, gives a single band of molecular mass 97kDa when subjected to SDS PAGE, and we have named it phosphorylase bl.…”

mentioning

confidence: 97%

Molecular studies of glycogen phosphorylase b from bovine liver

Artigas

Barón

Parody-Morreale

1995

International Journal of Biological Macromolecules

View full text Add to dashboard Cite

Two active isoforms of bovine liver phosphorylase with distinct subunit composition have previously been purified (Cámara Artigas, A., Barón, C. and Parody-Morreale, A. Prot. Express. Purif. 1994, 5, 157), one showing three SDS-PAGE polypeptide bands (molecular mass = 97, 55 and 40 kDa) and the other showing just one (molecular mass = 97 kDa). A molecular mass of 200 kDa has been determined for the native enzymes by gel filtration. Amino acid analyses have been performed in both cases, giving the same results which are similar to those obtained with other phosphorylases. SDS-PAGE experiments at different concentrations of the three-band enzyme have suggested a 1:1:1 stoichiometry between the polypeptides. The pyridoxal-5'-phosphate site is located in the 55 kDa polypeptide and the phosphorylation site in the 40 kDa one. These polypeptides can be generated from the three-band enzyme by tryptic attack in the presence of glycogen without loss of enzyme activity. In the absence of glycogen, 55 kDa and 38 kDa polypeptides are generated, with a significant decrease in activity. We conclude that the three-band enzyme is a dimer composed of an intact monomer and a broken one. The lyotropic salt activation site of the enzyme is near the amino terminal group.

show abstract

“…Κρύσταλλοι της R διαμόρφωσης ε'χουν επίσης αναπτυχθεί για τη μυϊκή φωσφορυλάση καρχαρία (Fletterick & Madsen, 1980), χοίρου (Oikonomakos et al, 1985; και της ηπατικής φωσφορυλάσης μοσχαριού (Hwang et al, 1984) αλλά δεν έχουν γίνει ακόμα αναλυτικές κρυσταλλογραφικές μελέτες. Πρόσφατα επίσης αναφέρθηκε ότι αναπτύχθηκαν τετραγωνικοί κρύσταλλοι (ομάδα χώρου Ρ422, a=b=l6l.l2 A, c= 175.49 Α με ένα διμερές ανά ασύμμετρη μονάδα) φωσφορυλάσης από ζύμη (S. cerevisiae) στην Τ διαμόρφωση (Hwang et al, 1990).…”

Section: J) κρυστάλλωση της φωσφορυλάσης του γλυκογόνουunclassified

Αλλοστερικος Και Καταλυτικος Μηχανισμος Της Φωσφορυλασης Του Γλυκογονου: Κινητικες Και Κρυσταλλογραφικες Μελετες Στην R (Ενεργο) Διαμορφωση Του Ενζυμου

Leonidas¹,

Λεωνίδας²

View full text Add to dashboard Cite

ΥΛΙΚΑ 43 ΟΡΓΑΝΑ 43 ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 44 3.1 Παρασκευή φωσφορυλάσης b. 44 3J2 Παρασκευή φωσφορυλάσης a 44 33 Παρασκευή φωσφορυλάσης b' 44 3.4 Παρασκευή αποφωσφορυλάσης 45 3 J) Ανασύσταση της αποφωσφορυλάσης με 5*-οΊφωσφορική πνρώοξάλη (PLPP) 45 3.6 Ανάπτυξη μονοκλινών κρυστάλλων φωσφορυλάσης b 45 3.7Ανάπτυξη μικροκρυστάλλων φωσφορυλάσης a και b 47 ΑΝΑΑΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 47 3.8 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας σε διάλυμα 47 3.9 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας σε μυφοκρυστάλλους 3.10 Επεξεργασία κινητικών δεδομένων 3.11 Μέτρηση πρωτεϊνικής συγκέντρωσης 3.12 Υπερφνγοκέντρηση 3.13 Φασματοσκοπία EPR. 3.14 Συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων 3.15 Ανάλυση κρυσταλλογραφικών δεδομένων 3.16 Βελτίωση (refìnement) της πρωτεϊνικής δομής 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 64 4.1 Η ενεργοποίηση της φωσφορυλάσης b από το θειικό αμμώνιο 4.1.1 Κινητικές μελέτες 4.1.2 Μελέτες EPR 4.13 Μελέτες υπερφυγοκέντρησης 4.2 Επίδραση του θειικού αμμωνίου στη φωσφορυλάση b' 43 Μελέτες στην τετραμερή μορφή της φωσφορυλάσης b 43.1 Ιδιότητες τετραμερούς φωσφορυλάσης b στο διάλυμα 43.2 Κινητικές ιδιότητες κρυσταλλικής φωσφορυλάσης b και a 82 433 Επίδραση του θειικού αμμωνίου στην ενεργοποίηση της διμερούς φωσφορυλάσης b από ολχγοσακχαρίτες 86 4.4 Μελέτη του καταλυτικού μηχανισμού της φωσφορυλάσης. Κρυσταλλογραφική μελέτη της φωσφορυλάσης b με συνένζυμο την y-δκρωσφορική πυριδοξάλη (PLPP) στη θέση του φυσικού συνενζύμου, S-φωσφορικής πυριδοξάλης (PLP) 87 4.4.1 Η δομή της ΡΕΡΡφοσφορυλάσης 88 4.42 Η δομή της S -δΊφωσφορικής πυριδοξάλης 91 4.43 Σύγκριση της δομής της PLPP-GPb με την Τ διαμόρφωση 95 4.4.4 Η θέση της δεύτερης φωσφορικής ομάδας της PLPP 96

show abstract

Purification and crystallization of bovine liver phosphorylase

Cited by 15 publications

References 28 publications

Glycogen phosphorylase isoenzymes from hepatoma 3924A and from a non-tumorigenic liver cell line. Comparison with the liver and brain enzymes

Glycogen phosphorylase isoenzymes from hepatoma 3924A and from a non-tumorigenic liver cell line. Comparison with the liver and brain enzymes

Molecular studies of glycogen phosphorylase b from bovine liver

Αλλοστερικος Και Καταλυτικος Μηχανισμος Της Φωσφορυλασης Του Γλυκογονου: Κινητικες Και Κρυσταλλογραφικες Μελετες Στην R (Ενεργο) Διαμορφωση Του Ενζυμου

Contact Info

Product

Resources

About