Purification and concentration of RNA polymerase on Ni-lipid monolayers

Purification of RNA Polymerase Elongation Complexes for Cryoelectron Microscopy Investigation

“…Сборка элонгационного комплекса ЕС+39. Для получения элонгационного комплекса в положении +39 от начала нуклеосомы использовали РНКполимеразу E. coli, экспрессированную и очищенную, как было описано нами ранее [9]. Реакцию транскрипции проводили по методике, опубликованной в работе Гайкаловой с соавт.…”

“…1А). Этот метод был применен нами ранее для очистки РНК-полимеразы от глицерина [9]. Метод заключается в наслаивании смеси липидов (фосфатидилхолина и DGS-NTA(Ni) в различных соотношениях) на раствор, содержащий комплексы РНК-полимеразы.…”

“…Было обнаружено, что при концентрировании очищенного на гепарине комплекса ЕС+39 на аффинном монослое в условиях, аналогичных описанным нами ранее [9], происходит агрегация комплексов с образованием длинных цепочек (рис. 1Б).…”

The Three-Dimensional Structure of (+39) RNA-Polymerase Elongation Complex Determined by Cryo-Electron Microscopy

“…This sequence of nucleotides allowed to obtain an elongation complex with an RNA-polymerase stalled at position of +39 base pairs from entering the nucleosomal DNA during transcription, in the presence of a limited set of ribonucleotides. The nucleosome reconstitution, the assembly of the elongation complex of the RNA-polymerase with the nucleosome and its purification on the affinity monolayer were carried out as described elsewhere [6][7].…”