PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENZIMA SIMILAR A TROMBINA DEL VENENO DE LA SERPIENTE Bothrops brazili

Abstract

Se ha purificado una enzima coagulante del veneno de la serpiente Bothrops brazili denominada enzima similar a trombina (TLE) mediante tres pasos cromatográficos sucesivos sobre Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, empleando buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,5. La enzima fue purificada 15,9 veces con un rendimiento del 28,6 % y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteica de 48 kDa, tanto en condiciones reductoras como no reductoras usando 2β-Mercaptoetanol. Se trata de una proteína con actividad coagulante, tanto sobre plasma humano citratado como sobre fibrinógeno bovino. La enzima mostró actividad amidolítica sobre el sustrato cromogénico Benzoil-Arginil-p-Nitroanilina (BApNA) y la potencia coagulante sobre el fibrinógeno bovino fue calculada en 121 unidades NIH de trombina/mg. La enzima fue inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya, por lo que se trata de una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,5 y la proteína fue estable al tratamiento térmico solo hasta los 40 ºC. La dosis defibrinogenante mínima fue 8 μg/g de ratón y mediante pruebas de inmunodifusión doble se observó inmunorreactividad con respecto al suero antibotrópico polivalente del INS.

Determinación De La Eficiencia De Secreción De Una Proteína Recombinante en La Levadura S. Cerevisiae Mediante Análisis Electroforético Y Detección Por Western Blot

“…Finalmente, todas las muestras fueron tratadas a 96 °C por 5 min. Para las separaciones electroforéticas (SDS-PAGE) se siguió un procedimiento similar al descrito por el Dr. Armando Yarlequé y colegas 15,16 .…”

ANÁLISIS BIOQUÍMICO DE DOS FRACCIONES CON ACCIÓN ANTICOAGULANTE DE LAS HOJAS DE Oenothera rosea “CHUPASANGRE”

“…Los coágulos estables (trombos) formados no se degradan rápidamente, si no se aplica un componente bioactivo específico como el que se está investigando. La trombina es una serina proteasa inhibida por el complejo endógeno heparina -antitrombina C y también por el reactivo fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), el cual genera una reacción irreversible con la serina 195, constituyente del sitio activo de la enzima 15 .…”

“…Por otra parte, es necesario considerar que la Tb y EST tienen sus centros activos semejantes con la triada catalítica: His57, Asp 102 y Ser 195; lo que motivó su utilización en esta investigación. Adicionalmente, es necesario indicar que la EST no es inhibida por heparina ni tampoco se origina de un zimógeno (protombina) como es el caso de la Tb 15 .…”