Proteomic Analysis of Trypanosoma cruzi Developmental Stages Using Isotope-Coded Affinity Tag Reagents

Abstract

Comparative proteome analysis of developmental stages of the human pathogen Trypanosoma cruzi was carried out by isotope-coded affinity tag technology (ICAT) associated with liquid cromatography-mass spectrometry peptide sequencing (LC-MS/MS). Protein extracts of the protozoan trypomastigote and amastigote stages were labeled with heavy (D8) and light (D0) ICAT reagents and subjected to cation exchange and avidin affinity chromatographies followed by LC-MS/MS analysis. High confidence sequence information and expression levels for 41 T. cruzi polypeptides, including metabolic enzymes, paraflagellar rod components, tubulins, and heat-shock proteins were reported. Twenty-nine proteins displayed similar levels of expression in both forms of the parasite, nine proteins presented higher levels in trypomastigotes, whereas three were more expressed in amastigotes.

Pathogenesis of Chagas' Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity

“…The observation that 18% of the protein-encoding genes may be present at Ն14 copies suggests that the number of variant proteins may be greater than 20,000 (29). Two-dimensional (2D) gel and mass spectrophotometric analyses (300,301) have identified 2,784 proteins, accounting for approximately 10% of the predicted proteome (29).…”

Genome of the Opportunistic Pathogen Streptococcus sanguinis

“…The suspension was centrifuged (5,000 ϫ g for 15 min at 4°C) to remove unbroken cells and large cellular debris. The supernatant was suspended in solubilization buffer as previously described (68) and was precipitated with a 2D clean-up kit (GE Healthcare). After reduction with dithiothreitol and iodoacetamide alkylation, proteins (ϳ75 g) were digested overnight with trypsin.…”

Interação parasita-célula hospedeira: modificação de proteínas de Tripanosoma cruzi durante adesão à matriz extracelular

“…A publicação do genoma de T. cruzi (El-Sayed et al, 2005), as análises in silico de quinomas e fosfatomas de alguns tripanosomatídeos (Parsons et al, 2005, Naula et al, 2005, Urbaniak, et al, 2012, Brenchley, et al, 2007, assim como os proteomas comparativos de diferentes formas de vida de T. cruzi e T. brucei (Atwood et al, 2005, Paba et al, 2004, Parodi-Talice et al, 2007, permitiram o avanço no conhecimento dos componentes de vias de sinalização presentes nos parasitas.…”

“…Embora o efeito da fosforilação de I/6 ainda não tenha sido relatado, a fosforilação dessa proteína foi descrita em parasitas aderidos a fibronectina, o que pode estar relacionado com as modificações no citoesqueleto e consequente controle da motilidade do parasita. Como predito, proteínas do paraflagellar rod e tubulinas foram identificadas no proteoma de todos os estágios de T. cruzi (Parodi-Talice, et al, 2007, Atwood, et al, 2005, Paba, et al, 2004 e apresentaram modificações significativas por PTMs, observadas nesse trabalho. Embora nenhuma modificação na arquitetura dos microtúbulos ou do paraflagellar rod tenha sido evidenciada em parasitas incubados com ECM, fibronectina ou laminina com a metodologia empegada (figuras 27 e 29), as modificações por fosforilação observadas no fosfoproteoma podem ser importantes para o controle da afinidade com outras proteínas pertencentes a diferentes cascatas de sinalização.…”

“…Há uma redução nos níveis dessas proteínas do paraflagellar rod durante a diferenciação de tripomastigota a amastigota devido ao encurtamento e desaparecimento do flagelo, embora a concentração de tubulina tenha se mantido constante, com um pequeno aumento apenas nas formas tripomastigotas (Paba, et al, 2004). Como ocorre para tubulina, a função dos ciclos de fosforilação/desfosforilação de proteínas do paraflagellar rod ainda é desconhecida.…”