Protein Phosphorylation Dynamics: Unexplored Because of Current Methodological Limitations

Abstract

The study of intrinsic phosphorylation dynamics and kinetics in the context of complex protein architecture in vivo has been challenging: Method limitations have prevented significant advances in the understanding of the highly variable turnover of phosphate groups, synergy, and cooperativity between P‐sites. However, over the last decade, powerful analytical technologies have been developed to determine the full catalog of the phosphoproteome for many species. The curated databases of phospho sites found by mass spectrometry analysis and the computationally predicted sites based on the linear sequence of kinase motifs are valuable tools. They allow investigation of the complexity of phosphorylation in vivo, albeit with strong discrepancies between different methods. A series of hypothetical scenarios on combinatorial processive phosphorylation is proposed that are likely unverifiable with current methodologies. These proposed a priori postulates could be considered as possible extensions of the known schemes of the activation/inhibition signaling process in vivo.

Optical chemosensors for the detection of proximally phosphorylated peptides and proteins

“…52 However, facile and robust detection of protein phosphorylation remains a challenge for many applications due to method limitations. 53 As such, convenient and high-throughput analytical solutions for studying protein proximal phosphorylation are in great demand. This review will cover optical sensing of proximal phosphorylation on peptides and proteins.…”

Papel del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas C (PDGF-CC) sobre mecanismos celulares asociados a un modelo de disfunción endotelial inducida por alta concentración de D-glucosa

“…Se conoce que la activación de proteínas quinasas, como Akt, se alcanza después de ejercer un estímulo extracelular especialmente con factores de crecimiento, como PDGF-C (Klomp et al, 2016) y la duración de su activación es crítica para el alcance de sus efectos biológicos (Marshall., 1995). De esta forma, los eventos de señalización asociados a fosforilación son complejos, ocurren rápidamente y pueden ser transitorios debido a la activación conjunta de proteínas fosfatasas (Robichon et al, 2020, Marshall., 1995. Aun cuando nuestros tiempos de tratamiento con PDGF-C para los ensayos de activación de Akt y eNOS fueron de 5 minutos y 1 hora, no fue posible detectar la activación de Akt inducida por PDGF-C, pero si la fosforilación de eNOS en los dos tiempos de tratamiento.…”

“…Figura 3. Producción de radical superóxido (O2 .-) en los complejos I y III de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (adaptado de: Nolfi-Donegan et al, 2020. Imagen creada en BioRender.com.…”

“…Para la activación de la vía PI3K/Akt se evaluó la fosforilación de Akt en Thr308 y en Ser473, para la activación de la vía MAPK se evaluó la fosforilación de ERK1/2 en Thr202/Tyr204 y para la activación de la eNOS se evaluó la fosforilación en la Ser1177. HAECs fueron cultivadas en flasks de cultivo T25 y tratadas como se menciona en la tabla 6, teniendo en cuenta que los eventos de señalización asociados a fosforilación dependiente de proteínas quinasas ocurren rápidamente y pueden ser transitorios debido a la acción conjunta de proteínas fosfatasas (Robichon., 2020, Ardito et al, 2017. Adicionalmente, el efecto de los inhibidores LY294002 (PI3K) o PD98059 (MEK1/2) fue evaluado en células con tratamiento de HG durante 5 horas, seguido de 20 µM de LY294002 o 10 µM de PD98059 durante 1 hora y PDGF-C durante 1 hora, con el fin de encontrar la relación entre la estimulación con PDGF-C y la inhibición de la actividad de las vías PI3K/Akt (Ikeda et al, 2011) y MAPK (Peng et al, 2021).…”

“…Tomando como base los resultados y los tiempos de tratamiento mostrados en el apartado anterior, se evaluó el efecto de PDGF-C sobre la activación de la vía de señalización PI3K/Akt y la eNOS, involucradas en la producción de NO y la activación de la vía de señalización MAPK involucrada en la producción de ET-1, en HAECs sometidas a HG. Para estos ensayos se establecieron tiempos cortos de tratamiento con PDGF-C detallados en la tabla 4, dado que los eventos de señalización asociados a fosforilación ocurren rápidamente y pueden ser transitorios debido a la acción conjunta de proteínas fosfatasas (Robichon., 2020, Ardito et al, 2017.…”