Production and Characterization of Cross-Linked Aggregates of Geobacillus thermoleovorans CCR11 Thermoalkaliphilic Recombinant Lipase

Abstract

Immobilization of enzymes has many advantages for their application in biotechnological processes. In particular, the cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) allow the production of solid biocatalysts with a high enzymatic loading and the advantage of obtaining derivatives with high stability at low cost. The purpose of this study was to produce cross-linked enzymatic aggregates (CLEAs) of LipMatCCR11, a 43 kDa recombinant solvent-tolerant thermoalkaliphilic lipase from Geobacillus thermoleovorans CCR11. LipMatCCR11-CLEAs were prepared using (NH4)2SO4 (40% w/v) as precipitant agent and glutaraldehyde (40 mM) as cross-linker, at pH 9, 20 °C. A U10(56) uniform design was used to optimize CLEA production, varying protein concentration, ammonium sulfate %, pH, glutaraldehyde concentration, temperature, and incubation time. The synthesized CLEAs were also analyzed using scanning electron microscopy (SEM) that showed individual particles of <1 µm grouped to form a superstructure. The cross-linked aggregates showed a maximum mass activity of 7750 U/g at 40 °C and pH 8 and retained more than 20% activity at 100 °C. Greater thermostability, resistance to alkaline conditions and the presence of organic solvents, and better durability during storage were observed for LipMatCCR11-CLEAs in comparison with the soluble enzyme. LipMatCCR11-CLEAs presented good reusability by conserving 40% of their initial activity after 9 cycles of reuse.

Estrategias de inmovilización enzimática

“…Las uniones intermoleculares mantienen la red de entrecruzamiento estable con el uso de reactivos bifuncionales, como diiminoésteres, dihidrinas, diaminas y tripolifosfato de sodio, esto después de la precipitación, entre ellos ell glutaraldehído es el reactivo más usado para el entrecruzamiento ya que es económico y tiene alta afinidad a grupos ε-amino que se encuentran en lisinas (Oliart-Ros et al, 2021;Sheldon, 2011). A pesar de la popularidad del glutaraldehído como agente de entrecruzamiento, su uso no es siempre recomendado, ya que algunas enzimas pierden su actividad o su estabilidad frente a él; por ello, en lugar del glutaraldehído se han implementado técnicas que utilizan moléculas bifuncionales alternas para sintetizar CLEAs tales como el agar, el quitosano, el dextrano, la pectina y la goma arábiga (Nadar et al, 2017).…”

“…Aunque una desventaja en la síntesis de CLEAs estriba en que los agentes y las condiciones del proceso pueden modificar la estructura de las enzimas o incluso provocar la pérdida de la actividad, la producción de CLEAs goza de popularidad, esto debido a que los CLEAs tienen una considerablemente mayor resistencia a la desnaturalización térmica y al almacenamiento. La actividad catalítica de los CLEAs de la lipasa termoalcalófila de Geoobacillus thermoleovorans CCR11 se mantuvo al 100 % durante un periodo de almacenamiento de 30 días a 4°C y 25°C, esto representa cuatro veces más de resistencia al almacenamiento que la forma soluble (Oliart-Ros et al, 2021).…”