Apesar de existirem diferentes metodologias para coleta de microrganismos das mãos, há carência de estudos comparativos. Nesse sentido, objetivamos quantificar potenciais cepas patogênicas nas mãos de profissionais de enfermagem de um hospital público do Sul do Brasil, a partir da avaliação comparativa de métodos de coleta. Para isso, realizamos um estudo transversal, experimental e quali-quantitativo, durante o ano de 2019, sob aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa com Seres Humanos. Comprovamos que enxágue com luva é a metodologia indicada para coletas microbiológicas das mãos, já que recuperou 42,19% dos microrganismos, enquanto o swab recuperou 1,91%. A partir disso, realizamos coletas, quantificação e identificação de microrganismos nas mãos de profissionais de enfermagem. Para os microrganismos aeróbios mesófilos a quantificação variou de 5X104 a 4X106 UFC/mão, para os Staphylococcus coagulase positiva variou de 5X104 a 3X106 UFC/mão e para os fungos de 5X104 a 2X106 UFC/mão. Dentre os fungos as leveduras dominaram em 93,73%, sendo identificado, com frequência, o gênero Candida spp. Não foram encontrados coliformes totais e termotolerantes. Staphylococcus aureus estiveram em 90,91% das mãos, sendo realizado Teste de Sensibilidade aos Antibióticos em 25 colônias isoladas, todas testando resistência a pelo menos três classes de antibióticos, mostrando serem multirresistentes. A análise dos dados mostrou que o melhor método de coleta é o de enxágue com luva, pois recupera maior quantidade e diversidade microbiana que o método comparado. Além disso, foi possível observar a importância das mãos como fontes de contaminação cruzada entre pacientes.