Predicting the applicability of PCR-RFLP analysis for testing grape varietal diversity

Abstract

Для геноидентификации технических сортов винограда может быть применен молекулярно-генетический анализ по локусу гена UFGT (UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase - уридиндифосфат-глюкоза:флавоноид 3-О-глюкозилтрансфераза) Vitis vinifera L. длиной 705 нуклеотидов, насчитывающий 34 полиморфные позиции (1 INDEL и 33 SNPs). Тогда как при ДНК-аутентификации виноматериалов и вин целесообразен анализ локуса меньшей длины (из-за сильной фрагментации остаточных нуклеиновых кислот винограда, экстрагируемых из винного дебриса), затрагивающий 5 детектируемых полиморфных позиций (1 INDEL и 4 SNPs), интерпретация которых может позволить охарактеризовать 13 UFGT-ген-ассоциированных групп не только методом прямого секвенирования специфичного ПЦР-продукта, но и другими подходами, требующими отработки. Поэтому целью настоящего исследования являлась прогнозная оценка применимости ПЦР-ПДРФ-анализа для детекции 5 диагностически значимых полиморфных позиций и последующей идентификации 13 UFGT -ген-ассоциированных групп Vitis vinifera L. при тестировании сортового многообразия винограда, а также производимого из него виноматериала. Выделение ДНК из пробоподготовленного биоматериала может быть выполнено коммерческим набором innuPREP Plant DNA Kit, а постановка ПЦР с праймерами UFGT-F1 и UFGT-R2 - Phire Plant Direct PCR Master Mix. ПДРФ-анализ осуществляется с подобранными эндонуклеазами рестрикции ( Pst I, Bsa XI, Bts I Mut I и Hinf I). Детекция ПЦР-ПДРФ-фрагментов выполняется визуализацией электрофореграмм в УФ-трансиллюминаторе. Выравнивание и рестрикционное картирование референсных нуклеотидных последовательностей локуса UFGT гена Vitis vinifera L. проведено с применением программ BLAST, ClustalW и NEBcutter V2.0, с последующим моделированием соответствующих ПЦР-ПДРФ-профилей. В результате исследования установлено, что применимость ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации 13 UFGT -ген-ассоциированных групп Vitis vinifera L. прогнозируемо достигается подбором диагностически ценных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых способна дискриминировать определенную полиморфную позицию, включая последнюю, детектируемую благодаря модификации обратного праймера UFGT-R2, приводящего к искусственно создаваемому сайту рестрикции для Hinf I при SNP c заменой цитозина (C) на гуанин (G). For the genoidentification of industrial grape varieties, molecular genetic analysis can be used for the locus of the UFGT gene (UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase) Vitis vinifera L. 705 nucleotides long, with 34 polymorphic positions (1 INDEL and 33 SNPs). Whereas, for DNA authentication of wine materials and wines, it is advisable to analyze a shorter locus (due to strong fragmentation of residual grape nucleic acids extracted from wine debris), affecting 5 detectable polymorphic positions (1 INDEL and 4 SNPs), the interpretation of which can characterize 13 UFGT -gene-associated groups not only by direct sequencing of a specific PCR product, but also by other approaches that require development. Therefore, the aim of this study was a predictive assessment of the applicability of PCR-RFLP analysis for the detection of 5 diagnostically significant polymorphic positions and the subsequent identification of 13 UFGT -gene-associated groups of Vitis vinifera L. when testing the grape varietal diversity, as well as the wine material produced from it. Isolation of DNA from the sample prepared biomaterial can be performed using the commercial kit «innuPREP Plant DNA Kit», and PCR with primers UFGT-F1 and UFGT-R2 can be performed using the «Phire Plant Direct PCR Master Mix». RFLP analysis is performed with selected restriction endonucleases ( Pst I, Bsa XI, Bts I Mut I and Hinf I). Detection of PCR-RFLP fragments is performed by visualization of electrophoregrams in a UV transilluminator. Alignment and restriction mapping of the reference nucleotide sequences of the UFGT locus of the Vitis vinifera L. gene was carried out using the BLAST, ClustalW, and NEBcutter V2.0 programs, followed by modeling of the corresponding PCR-RFLP profiles. As a result of the study, it was found that the applicability of PCR-RFLP analysis for the identification of 13 UFGT -gene-associated groups of Vitis vinifera L. is predictably achieved by the selection of diagnostically valuable restriction endonucleases, each of which is able to discriminate a certain polymorphic position, including the last one, detected due to the modification of the reverse primer UFGT-R2, leading to an artificially created restriction site for Hinf I in SNP with the replacement of cytosine by guanine.