Precise Excision of the CAG Tract from the Huntingtin Gene by Cas9 Nickases

Abstract

Huntington's disease (HD) is a progressive autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by the expansion of CAG repeats in the first exon of the huntingtin gene (HTT). The accumulation of polyglutamine-rich huntingtin proteins affects various cellular functions and causes selective degeneration of neurons in the striatum. Therapeutic strategies used to date to silence the expression of mutant HTT include antisense oligonucleotides, RNA interference-based approaches and, recently, genome editing with the CRISPR/Cas9 system. Here, we demonstrate that the CAG repeat tract can be precisely excised from the HTT gene with the use of the paired Cas9 nickase strategy. As a model, we used HD patient-derived fibroblasts with varied numbers of CAG repeats. The repeat excision inactivated the HTT gene and abrogated huntingtin synthesis in a CAG repeat length-independent manner. Because Cas9 nickases are known to be safe and specific, our approach provides an attractive treatment tool for HD that can be extended to other polyQ disorders.

Strategie wyciszania ekspresji zmutowanego genu w terapii choroby Huntingtona

“…non-homologous end joining) [53]. Przy pomocy tej technologii można wpłynąć na transkrypcję HTT na wiele sposobów począwszy od wycięcia powtórzeń CAG czy poprzez przesunięcie ramki odczytu i wystąpienie w ten sposób przedwczesnych kodonów stop [33,54,55]. W badaniach in vitro na liniach komórkowych wykazano obniżenie poziomu zmutowanej huntingtyny [53], co następnie potwierdzono na modelu mysim HD, w którym wyłączenie ekspresji zmutowanego białka skutkowało polepszeniem się fenotypu gryzoni [56].…”

Genselektive Therapieansätze bei der Huntington-Krankheit

“…Eine der ersten strategischen Fragen zur Anwendung der Geneditierung bei der HK ist, ob HTT-kodierende Sequenzen ganz eliminiert oder ob alternativ die pathologisch verlängerte CAG-Basentriplettsequenz modifiziert werden soll. In präklinischen Studien mit Fibroblasten von HK-Patienten konnte gezeigt werden, dass mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems eine präzise Exzision von CAG-Basentripletts aus dem HTT-Gen erreicht werden kann [35]. Mehrere präklinische Studien zeigen, dass eine intrakranielle Verabreichung der CRISPR/Cas9-Komplexe mittels viraler Vektoren zu einer robusten, entweder allelselektiven oder nichtallelselektiven HTT-Inaktivierung führt, die in transgenen Mäusen den klinischen und neuropathologischen Phänotyp verbessert [36,37].…”

Therapeutics Advancement for Huntington Disease

“…CRISPR-Cas9 are involved in bacterial defense mechanism which recognizes and destroy foreign DNA. CRISPR-Cas9 involved in the excision of CAG repeats to make harmless alleles and silencing the mHTT expression by insertion of stop codons/missense mutations [76,[120][121][122][123]. In mouse (HD140Q-knockin mice) model, CRISPR-Cas9 involved in the reduction of mHTT, and improvement of motor function, but not increases lifespan [77].…”