Pre-analytical Practices in the Molecular Diagnostic Tests, A Concise Review

Abstract

Molecular assays for detection of nucleic acids in biologic specimens are valuable diagnostic tools supporting clinical diagnoses and therapeutic decisions. Pre-analytical errors, which occur before or during processing of nucleic acid extraction, contribute a significant role in common errors that take place in molecular laboratories. Certain practices in specimen collection, transportation, and storage can affect the integrity of nucleic acids before analysis. Applying best practices in these steps, helps to minimize those errors and leads to better decisions in patient diagnosis and treatment. Widely acceptable recommendations, which are for optimal molecular assays associated with pre-analytic variables, are limited. In this article, we have reviewed most of the important issues in sample handling from bed to bench before starting molecular tests, which can be used in diagnostic as well as research laboratories. We have addressed the most important pre-analytical points in performing molecular analysis in fixed and unfixed solid tissues, whole blood, serum, plasma, as well as most of the body fluids including urine, fecal and bronchial samples, as well as prenatal diagnosis samples.

Accelerating the Development and Validation of Liquid Biopsy for Early Cancer Screening and Treatment Tailoring

“…Pre-analytical variability is a vital issue. Errors in the pre-analytical phase—specimen collection and processing, transport and storage, cDNA isolation, and quality controls—can heavily affect the data generated in the following analytical steps, resulting in unreliable results which ultimately can lead to incorrect clinical decisions [ 87 ].…”

Importancia del adecuado protocolo de extracción de DNA para estudios moleculares

“…Algunos anticoagulantes afectan de forma negativa los resultados analíticos, el caso de la heparina es controversial en los estudios moleculares, existen estudios que demuestran que si no se elimina durante la extracción de DNA, su presencia afectaría negativamente aquellos estudios que utilicen métodos enzimáticos. [2][3][4] Por otra parte, la extracción de DNA para secuenciación a partir de muestras colectadas en tubos que contienen ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) como anticoagulante es aceptable. Sin embargo, es importante considerar que independientemente del tubo que se utilice, es necesaria la homogenización adecuada de la muestra en el tubo con sangre total, pues la formación de coágulos provocará atrapamiento celular, reduciendo no sólo la cantidad de células nucleadas disponibles, sino también restará eficacia a los mecanismos de acción de las disoluciones de lisis tanto de eritrocitos como de leucocitos; todo esto en conjunto impactará negativamente sobre el rendimiento final del proceso de extracción de DNA.…”

“…Previo a la extracción de DNA, la sangre completa puede almacenarse temporalmente a temperatura ambiente hasta 24 horas o en el refrigerador (2-8 o C) durante tres a cuatro días, que es el tiempo óptimo en que debería procesarse la muestra, principalmente para estudios de metilación, en caso de no contar con un refrigerador, se pueden alcanzar estas condiciones con uso de hielo simple y una hielera; sin embargo, para estudios de secuenciación es utilizable hasta 15 días a temperatura ambiente despúes de la toma de muestra, aunque se demostró que después de esto, la calidad del DNA no disminuye considerablemente respecto a las procesadas antes de dichos días, aunque la concentración de DNA en los resultados sí se ve disminuida de manera considerable. 4,[6][7][8] Para el transporte de grandes distancias que requieran la congelación de muestras de sangre total, deben utilizarse recipientes de polipropileno en lugar de vidrio, y de preferencia dividirlas en alícuotas para evitar el congelamiento y descongelamiento de la muestra, ésta es otra opción en la obtención de la capa leucocitaria, pero requerirá de resguardo a -70 o y sólo será viable por un par de días, 9 por lo que no sería de mucha utilidad.…”

Taking a step back from testing: Preanalytical considerations in molecular infectious disease diagnostics

“… Perform validation studies to confirm sample integrity under standard and anticipated sample processing conditions. [27] , [29] Humidity High humidity can compromise dry oral/buccal swabs and dried blood spots stored under ambient conditions. Samples being left in specimen lock box for pick up, but pick up is delayed and lock box not insulated.…”

“… Consider pathogen’s incubation and latent period.Consider longitudinal performance of test being performed.Consider a specimen type that will yield high amounts of genetic material. [27] , [115] , [116] Antibiotic Treatment Potential false negative results due to insufficient genetic material of microorganism in specimen as result from treatment. Patient is empirically started on antimicrobials for C. difficile and is then tested for C. difficile with PCR toxin B genes, glutamate dehydrogenase.…”