Polymrase Chain Reaction (PCR) for the diagnosis of virus infection: human cytomegalovirus

Abstract

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ: ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА Описана процедура быстрого, чувствительного а точного определения цитомегаловируса (ЦМВ) β тканях и биологических жидкостях человека с помощью термофильной ДНК-по ли ме разы из Thermus thermophilus. Процедура состоит из двух последовательных ПЦР. Первая включает 40 циклов (денатурация ДНК, отжиг праймеров и ДНКполимеризация), выполняемых с двумя праймерами по 20 оснований, консервативная последовательность которых взята из гена MIE (major immediate early) ЦВМ. Вторая реакция включает от 20 до 50 циклов, аналогичных первым, но на основе 20-членных праймеров, фланкирующих внутреннюю часть фрагмента ДНК, намноженного ранее. Конечный фрагмент обнаруживается по окрашиванию бромистым этидием после электрофореза в полиакриламидном геле. Верификация искомой полосы включает ее рестрикционный анализ. С помощью плазмиды рСМ5018, несущей ген MIE вируса, показано,, что предлагаемая процедура может выявлять столь малые количества ДНК, как несколько (от 1 до 5) плазмидных молекул. Введение. Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) относится к числу широко распространенных заболеваний человека. Поражая детей раннего возраста и плод, она может стать причиной умственного недоразвития, глухоты, иммунного дефицита и целого ряда других аномалий [1]. Комплексное применение современных методов выявления МЦВИ (вирусологические, иммунофлюоресцентные, серологические, электронно-микроскопические и др.) раскрыло настораживающую картину распространенности ЦМВ (лит. см. в [1]). Оказалось, что от 40 до 100% взрослых людей разных стран имеют антитела к ЦМВ, т. е. были в контакте с данным вирусом или являются его носителями; 0,5-2 % всех новорожденных и 49-60 % детей раннего возраста инфицированы ЦМВ. По данным ВОЗ, частота летальных исходов (~2%) ЦМВИ не уступает таковой гриппозных инфекций. Все это свидетельствует о важности развития точных экспресс-методов диагностики ЦМВИ, особенно для целей диагностики у беременных и внутриутробного плода. Появление нового диагностического приема ПЦР [2], столь успешно используемого для молекулярного анализа генетических нарушений у человека, не могло оставить в стороне и диагностику ЦМВ [3]. Отметим, что на недавней 89-й Ежегодной встрече Американского общества микробиологов из 20 работ, посвященных диагностике ЦМВ, четыре были выполнены с помощью ПЦР [4-7]. В настоящей работе представлены результаты применения ПЦР на основе ДНК-полимеразы из Т. thermophilus для отработки эффективного, чувствительного и точного экспресс-метода выявления ЦМВ в биологических жидкостях и тканях людей, зараженных вирусом. Результаты исследования приведены ранее [8]. Материалы и методы. Плазмида рСМ5018 [9] построена на основе бактериального вектора pACYC184 и содержит фрагмент вирусной ДНК в районе гена MIE. Она не содержит ДНК человека.Выделение ДНК из тканей человека, приготовленных для стандартных гистологических исследований (фиксированных в формалине, парафинированных), проводили согласно[10] с незначительными модификациями. После удал...