Polymerase chain reaction detection of greening bacterium (Candidatus Liberibacter asiaticus) and Citrus mosaic virus in citrus tissues, by means of a simplified template-preparation protocol

Abstract

Application of a simplified protocol for nucleic acid preparation for polymerase chain reaction (PCR) detection of greening bacterium (Candidatus Liberibacter asiaticus; Cla) and Citrus mosaic virus (CMBV) associated with citrus is described. Crude extracts of citrus tissues in NaOH -ethylenediaminetetraacetic acid solution, prepared without the use of liquid nitrogen, were spotted on a nitrocellulose membrane (NCM) and then eluted in water at 80°C for 10 min. Both the greening bacterium and CMBV were detected by PCR from the eluted liquid from the spotted NCMs. The detection efficacy for the templates obtained in the NCM-eluted liquid was comparable with that of templates obtained with a multistep laboratory method or a commercial kit for nucleic acid preparation. The protocol is simple, inexpensive, rapid, and applicable to large-scale surveys of citrus trees. The spotted-membrane methodology can also be used for short-term sample storage for future testing or for long-distance sample transport to a detection laboratory.Résumé : Un protocole simplifié de préparation d'acide nucléique pour la détection, par réaction en chaîne de la polymérase, de la bactérie causant la maladie du dragon jaune (Candidatus Liberibacter asiaticus; Cla) et du virus de la mosaïque des agrumes (CMBV) présents chez les agrumes est décrit. Des extraits bruts de tissus d'agrumes, préparés dans une solution de NaOH et d'acide éthylènediamine-tétracétique, sans utiliser d'azote liquide, ont été appliqués sur une membrane de nitrocellulose pour être ensuite élués dans l'eau par un traitement thermique à 80°C durant 10 min. Tant la bactérie responsable de la maladie du dragon jaune que le CMBV ont été détectés par réaction en chaîne de la polymérase lorsque le liquide élué de membranes a été utilisé. Les gabarits dans le liquide élué ont permis une efficacité de détection équivalente à celle obtenue avec une méthode de laboratoire comportant plusieurs étapes ou avec une trousse commerciale de préparation d'acide nucléique. Le protocole est simple, peu coûteux, rapide et utilisable pour l'examen à grande échelle des agrumes. La méthodologie d'application sur membrane peut aussi servir à l'entreposage à court terme des échantillons pour un examen subséquent ou pour leur transport sur longue distance jusqu'à un laboratoire de détection. Mots-clés : CandidatusLiberibacter asiaticus, agrumes, virus de la mosaïque des agrumes, méthode de détection, réac-tion en chaîne de la polymérase. Baranwal et al.: citrus / bacteria and virus detection / polymerase chain reaction 196

Use of NCM Based DNA Extraction Method for Simultaneous Detection of <I>Citrus mosaic badnavirus</I> and <I>Candidatus</I> Liberibacter Asiaticus by Duplex PCR

“…In some herbaceous plants crude extract of denaturized sap is also used for detection purpose but as citrus is a woody plant its crude extract may contains PCR inhibitors and therefore direct plant sap may not be used for detection purpose. There was a report of successful detection of citrus pathogens individually using membrane based technique (Baranwal et al, 2007). In the present study however, we have developed a duplex PCR for simultaneous detection of CMBV and 'Ca.…”

“…However, most of the PCR assays developed for CMBV and 'Ca. Las', involves either multistep DNA isolation protocol or expensive commercial kit (La Notte et al, 1997;Baranwal et al, 2007). It is also not practical to rapidly index large scale field or nursery samples for pathogen testing.…”

“…Membrane based diagnosis is also reported for successful DNA isolation from infected plants (Baranwal et al, 2007;Singh et al, 2006). In some herbaceous plants crude extract of denaturized sap is also used for detection purpose but as citrus is a woody plant its crude extract may contains PCR inhibitors and therefore direct plant sap may not be used for detection purpose.…”

Rapid molecular detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium associated with citrus huanglongbing (greening) disease of Mandarin using polymerase chain reaction

“…The evaluation was also done using Taq and Klen Taq enzymes and Klen Taq as was expected gave better intensity of the bands obtained in 1% agarose gel. Similar evaluation for primer has also been used by other researchers with different viruses (Singh and Nie, 2003;Harakava et al, 2000;Das, 2004;Manjunath et al, 2008;Baranwal et al, 2007;Khairulmazmi et al, 2008;Naoya et al, 2008;Thiara et al, 2009;Albrecht and Kim Bowman, 2009;Deng et al, 2012).…”