Photoresponsive systems for biomolecular applications

Abstract

In dieser Arbeit wird sowohl das Potenzial von molekularen Photoschaltern als lichtempfindliche Komponenten für photopharmakologische Anwendungen als auch das von künstlichen RNA-Aptameren als regulatorische Schalteinheiten für die Entwicklung von funktionellen Riboschaltern untersucht. Verschiedene wesentliche Aspekte beider Anwendungs-felder wurden eingehend einzeln untersucht und die beiden Schaltsysteme schließlich durch das Design eines synthetischen RNA-Aptamers kombiniert, dessen Ligandbindung durch licht-induzierte Isomerisierung seines Photoschalterliganden reguliert werden kann. Molekulare Photoschalter wie Azobenzole und Spiropyrane haben sich als vielversprechende photochemische Werkzeuge erwiesen, um lichtgesteuert reversible und biochemisch nutzbare Effekte erzeugen. Spiropyrane bergen aufgrund der drastischen Veränderungen ihrer molekularen Eigenschaften infolge der Photoisomerisierung zum Merocyanin (MC) ein enormes Anwendungs-potenzial. Von den hier untersuchten wasserlöslichen Pyridin- (Py-) und Nitro-BIPS-Derivaten zeigt insbesondere die Py-BIPS-Verbindung 2 ein außerordentlich vielseitiges Verhalten. Im Vergleich zu anderen Vertretern dieser Photoschalterklasse wird ein deutlich höherer MC-Anteil von etwa 50% thermisch innerhalb von wenigen Minuten akkumuliert. Durch lichtinduzierten Ringschluss zum reinen Spiropyran (SP) und thermische Wiederherstellung des Gleichgewichts, kann diese hohe Schaltamplitude über mehrere Zyklen ohne signifikante Zersetzung beibehalten werden. Der Einsatz von schädlichem UV-Licht kann somit vermieden werden, was zusätzlich sehr vorteilhaft für einen möglichen Einsatz in einem biochemischen Kontext ist. Verbindung 2 weist zudem mehrere Protonierungsstellen auf, die ihr in Abhängigkeit des pH-Wertes faszinierende photosaure Eigenschaften verleihen. Das einfach protonierte HMC Isomer ermöglicht eine lichtstimulierte reversible Kontrolle des pH-Wertes in einem Bereich von etwa 4,5 bis 7,5, mit möglichen pH-Sprüngen von bis zu 1,5 Einheiten. Durch transiente Absorptionsstudien wurde ein Mechanismus für die Protonenfreisetzung nachgewiesen, der lediglich auf der Veränderung des pKs-Wertes der N-protischen Position infolge des lichtinduzierten Ringschlusses beruht. Im Gegensatz dazu wird das phenolische Proton des doppelt protonierten HMCH Isomers innerhalb von 1-2 Pikosekunden nach Anregung aus dem angeregten Zustand an das Lösemittel übertragen. Durch eingehende Ultrakurzzeitmessungen der Freisetzung des phenolischen Protons, konnten die protonierten Spezies der Py- und Nitro-Merocyanine als Superphotosäuren etabliert werden. Sie können somit als ultraschnelle Auslöser für protonenvermittelte Prozesse eingesetzt werden, die zu den fundamentalsten Reaktionen in der Natur gehören. Was potenzielle pharmakologische Zielsysteme betrifft, so dürfte RNA eine große Zukunft bevorstehen, da sie einfach zu synthetisieren ist und Zugang zu verschiedenen Ebenen zellulärer Regulationsmechanismen bietet. Insbesondere RNA-Aptamere, die in der Lage sind, niedermolekulare Liganden mit außergewöhnlich hoher Affinität und Spezifität zu binden, sind für die Entwicklung von künstlichen Riboschaltern hoch interessant. Während künstliche Aptamere für beliebige Liganden durch einen in vitro Selektionsprozess generiert werden können, ist nicht zur Gänze geklärt warum nur wenige von ihnen als aktive in vivo Riboschalter funktionieren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Bedeutung der konformationellen Aptamerdynamik während der Ligandenbindung für das Regulationspotential. Die Mg2+-abhängigen Bindungsstudien des hochfunktionellen Tetrazyklin (TC) -Aptamers zeigen, dass zweiwertige Kationen nicht nur für die korrekte Vorfaltung des Aptamers wichtig sind, sondern auch an der Ligandenbindung und RNA-Strukturanpassung selbst beteiligt sein können. Nach der Assoziation von TC an die Bindungstasche pflanzt sich eine Konformationsanpassung zur entfernten Dreifachhelixregion fort, wo Mg2+ zusätzlich für die Ausbildung endgültig gebundenen Zustandes benötigt wird. Neben dem Einfluss von Mg2+, zeigen zeitaufgelöste Ligandenbindungsstudien von drei Ciprofloxacin (CFX) -Aptameren eine klare Korrelation zwischen der Kinetik des Struktur-anpassungsschrittes der RNA an den Liganden und dem beobachteten Regulationspotenzial in parallel durchgeführten in vivo Assays. Es wird geschlussfolgert, dass eine beschleunigte und irreversible RNA-Anpassung auf eine Konformationsänderung hindeutet, die ausgeprägt genug ist, um eine Aktivität als Riboschalter zu ermöglichen. Diese Erkenntnisse werden durch die berichteten Ligandenbindungskinetiken von anderen künstlichen Aptameren und auch von natürlichen Riboschaltern bestätigt und sollten weitreichende Implikationen für die Optimierung von Selektionsprotokollen für funktionelle Aptamere haben. Schließlich wird ein lichtempfindliches RNA-Aptamer vorgestellt, dessen Ligand auf dem Antibiotikum Chloramphenicol (Cm) basiert, welches synthetisch mit einem Azobenzolfragment versehen wurde (azoCm). Durch systematische Optimierung von in vitro Selektionsprotokollen und die erfolgreiche Implementierung eines Belichtungsschrittes zur Isomerisierung des Liganden konnten Aptamere erhalten werden, die spezifisch an die trans-Form von azoCm binden. Bindungsaffinitätsstudien bestätigen diese Selektivität und durch Zirkulardichroismusstudien konnte zudem eine lichtinduzierte reversible Dissoziation des von cis-azoCm gezeigt werden. Damit wird hier eine erfolgreiche Entwicklungsstrategie für lichtabhängige RNA-Aptamer – Ligandsysteme dargelegt, welche wiederum fundamental neuartige Ansätze für die Erschließung lichtstimulierter biologischer Regulationswege zugänglich machen.