Photoaktivierbare, synthetische Ras-Proteine als „Köder“ für die Identifizierung Plasmamembran-assoziierter Bindungspartner des Ras-Proteins

Abstract

Die Regulation von Wachstums-und Differenzierungsprozessen durch die Proteine der Ras-Superfamilie [1] ist unabdingbar mit der korrekten subzellul‰ren Verteilung dieser kleinen Guanosintriphosphat(GTP)-Bindungsproteine ver-kn¸pft. [2] Die Ras-Proteine selbst kˆnnen ihre biologische Funktion nur dann wahrnehmen, wenn sie an der Plasmamembran der Zelle lokalisiert sind. Die Voraussetzung f¸r die erfolgreiche Adressierung bilden dabei posttranslationale Modifizierungen der Ras-Proteine wie S-Farnesylierung und S-Palmitoylierung am C-Terminus der Peptidkette. [3] Der Mechanismus dieser Translokation ist nach wie vor Gegenstand intensiver Diskussionen. So wird f¸r die Isoform K-Ras B das Modell einer unspezifischen, extrem negativ geladenen πanionischen Bindungsstelle™ postuliert, die sich zumindest teilweise aus Elementen der Lipiddoppelschicht zusammensetzt. Die Wechselwirkung mit der Plasmamembran erfolgt¸ber einen Farnesylthioether sowie¸ber ein polykationisches Element aus sechs Lysinresten, welche sich beide am C-Terminus des Proteins befinden. [4] Die beiden Isoformen H-und N-Ras werden zus‰tzlich zur S-Farnesylierung an einem oder zwei weiteren C-terminalen Cysteinresten S-palmitoyliert. Auf diesen Schritt baut das Modell der Membranfalle [5] auf: Eine f¸r diese Reaktion notwendige prenylproteinspezifische Palmitoyltransferase (PTase) ist spezifisch in der Plasmamembran lokalisiert und verst‰rkt mit der zweiten hydrophoben Modifizierung des zuvor nur isoprenylierten Ras-Proteins die urspr¸nglich reversible Membranbindung erheblich, sodass ein Verlassen der Zielmembran ohne vorherige Hydrolyse des Fetts‰urerests nahezu unmˆglich ist. Diesen Modellen stehen experimentelle Daten entgegen, die auf unterschiedlichen Transportwegen f¸r K-Ras auf der einen und H-oder N-Ras auf der anderen Seite an die Plasmamembran hinweisen. F¸r H-und N-Ras wird dabei eine Palmitoylierung bereits im endoplasmatischen Retikulum postuliert. [6]

Solid‐Phase Synthesis of Lipidated Peptides

“…We have synthesized several N‐Ras peptides carrying the maleimido group with different combinations of lipid patterns ( 22 – 24 ), such as the farnesylated and palmitoylated peptide 22 or the double farnesylated compound 24 (Figure 7a). Ras proteins bearing a photoactivatable benzophenone group are efficient tools to study the interaction and cross‐linking with possible Ras‐binding proteins 18. The interest in such proteins led us to synthesize lipidated peptides 25 and 26 carrying the benzophenone group (Figure 7b).…”

Synthesis and Biological Activity of Photoactivatable N-Ras Peptides and Proteins

“…Quantitative analysis of the biological response for the 11bpt conjugate showed that the transforming potential of the semisynthetic protein is ca. one-third the potential of full-length RasG12V . This activity is high enough to conclude that the processing of the BP-labeled mutant is not essentially altered.…”

“…Given the fact that the mechanisms of Ras palmitoylationand thereby the mechanisms for its localization to the plasma membranecould not be unraveled conclusively, the employment of new techniques extending beyond exisiting methodology appears to be required. “Photoaffinity labeling” (PAL) has gained considerable merit in analyzing protein−protein interactions (Figure ). , In the light of these findings, we reasoned that biologically active Ras proteins incorporating a photoactivatable group could serve as efficient tools 1 General principle of photoaffinity labeling. …”

Lipidierte Ras‐ und Rab‐Peptide und ‐Proteine: Synthese, Struktur und Funktion

“…Bei diesen Ansätzen wird ein Großteil der Peptidsequenz schnell an einem festen Träger synthetisiert, abgespalten und mit lipidierten Aminosäuren in Lösung verknüpft oder durch Alkylierung freier Thiolseitenketten im Cystein lipidiert. Solche Methoden sind recht häufig eingesetzt worden und waren besonders erfolgreich bei prenylierten Peptiden, wie Beiträge der Arbeitsgruppen um Naider,19, 35 Gelb,36–38 Poulter39 und Waldmann gezeigt haben 40–43…”

“…Hierbei wurden Isoprenoidfragmente im Farnesylrest substituiert, wobei die Modifizierung mit Benzophenongruppen die Isoprenoidfunktion nicht zu beeinträchtigen schien. Die biologische Aktivität Benzophenon‐modifizierter Ras‐Konstrukte konnte dementsprechend in einem zellulären Testsystem nachgewiesen werden, bei dem Phäochromozytomzellen (PC 12) nach Mikroinjektion onkogener Ras‐Mutanten mit einer Isopren‐Benzophenon‐Modifikation zu einem Neurit‐artigen Zelltyp differenzierten 40. Die Benzophenon‐Ras‐Lipoproteine zeigten nach Stimulation mit Sos eine erhöhte Nucleotidaustauschaktivität und lieferten nach Aktivierung eines Ras‐Sos‐Gemischs mit UV‐Licht ein spezifisches Kupplungsprodukt 41…”