Periplasmic expression of human growth hormone via plasmid vectors containing the  PL promoter: use of HPLC for product quantification

Abstract

The influence of different factors acting on Escherichia coli periplasmic expression of recombinant human growth hormone (hGH) in shake flask cultures has been investigated. Bacterial vectors containing the phage lambdaP(L) promoter, which is temperature activated, were utilized. Four different signal peptides were compared: DsbA, npr, STII and one derived from the natural hGH signal peptide, this last used as a reference. Other factors such as medium composition, optimized induction and expression conditions, and different bacterial strains were also studied. The determination of hGH, carried out directly in osmotic shock fluids, was based on an isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography method, which allows direct, rapid evaluation of the quality and quantity of hGH being secreted in the bacterial periplasmic space immediately after or even during fermentation. The level of hGH production increased 2.5-fold compared with the reference vector, reaching a level of 3.9 +/- 0.63 micro g/ml/A(600) (n = 6; coefficient of variation = 16.2%). The expression level was affected by the signal peptide and by the induction conditions, being more effective when activation started in the early logarithmic phase which, however, exhibited remarkably different optical density (OD) according to medium composition. Our results thus indicate that 6 h activation at 40-42 degrees C, starting with an OD (A(600)) of approximately 3 in a very rich medium, were conditions capable of providing the maximum secretion level for a vector utilizing the DsbA signal sequence and E.coli W3110 or RB791 as host cells.

Expression and rapid purification of recombinant biologically active ovine growth hormone with DsbA targeting to Escherichia coli inner membrane

“…Alternative expression systems have been based on the secretion of the protein into the E. coli periplasmic space, which not only allows a greater chance to obtain the protein in a folded and soluble form but also lower load of contaminating proteins in the periplasmic fluid makes purification process easier. Secretion process in the periplasmic space of E. coli cells mimics the natural process of somatotropic cells in the pituitary gland and has been achieved by linking the signal peptide sequence to the human GH (de Oliveira et al 1999;Teresa et al 2000;Soares et al 2003).…”

“…Various signal sequences have been studied so far for the expression and secretion of recombinant proteins like human GH (Soares et al 2003). The DsbA signal sequence when compared with other signal sequences (npr, PhoA, pelB) gave best periplasmic targeting in E. coli (Schierle et al 2003).…”

Influência da temperatura de cultivo na expressão de proteínas recombinantes de interesse terapêutico no espaço periplásmico bacteriano, utilizando o promotor lambda PL

“…Com exceção do IFNα2a desenvolvido durante esse estudo, as outras proteínas, hGH, hPRL e os antagonistas de prolactina G129R-hPRL e Δ1-9 G129R-hPRL já haviam sido produzidas no nosso laboratório (Oliveira, 1999;Soares, 2003;Soares, 2008, Heller, 2010 Nos estudos com o promotor  P L constitutivo, apesar da expressão ser teoricamente contínua, continuamos empregando o termo "ativação" para indicar o momento no qual a temperatura é elevada para o "início" da expressão. Embora em teoria esse termo "ativação" não faça muito sentido quando a expressão é constitutiva, na prática temperaturas mais baixas tendem a diminuir a ação do promotor  P L como relatado por Valdez-Cruz e colaboradores (2010).…”

“…Assim, podemos resumir que o ponto crítico dessa metodologia, baseada na mudança de temperatura, está relacionado com os problemas comumente associados com a expressão de proteínas em temperaturas relativamente altas como, por exemplo, proteólise e agregação, que podem influenciar negativamente a produção de proteínas particularmente lábeis. Níveis elevados da expressão do hormônio de crescimento humano (hGH) foram obtidos no laboratório do Centro de Biotecnologia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) utilizando um sistema baseado no promotor Lambda P L (P L ) controlado pelo regulador termo-sensível clts, inicialmente com a utilização de uma sequência sinalizadora derivada do gene natural do hGH (Oliveira, 1999) que depois foi substituída pela sequência do DsbA, natural de bactérias (Soares, 2003).…”

“…Dados da literatura indicam o seu uso em outras condições, como tratamento de fraturas ou displasias ósseas, queimadura de pele, crianças com baixa estatura idiopática, Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Nooman, uso na corticoterapia crônica e em idosos (Soares, 2003).…”