PCR analysis of the absolute number of copies of human chromosome 18 transcripts in liver and HepG2 cells

Abstract

Using reverse transcription in conjunction with the quantitative real-time PCR or digital droplet PCR, the transcriptome profiling of human chromosome 18 has been carried out in liver hepatocytes and hepatoblastoma cells (HepG2 cell line) in terms of the absolute number of each transcript per cell. The transcript abundance varies within the range of 0.006 to 9635 and 0.011 to 4819 copies per cell for HepG2 cell line and hepatocytes, respectively. The expression profiles for genes of chromosome 18 in hepatocytes and HepG2 cells were found to significantly correlate: the Spearman's correlation coefficient was equal to 0.81. The distribution of frequency of transcripts over their abundance was bimodal for HepG2 cells and unimodal for liver hepatocytes. Bioinformatic analysis of the differential gene expression has revealed that genes of chromosome 18, overexpressed in HepG2 cells compared to hepatocytes, are associated with cell division and cell adhesion processes. It is assumed that the enhanced expression of those genes in HepG2 cells is related to the proliferation activity of cultured cells. The differences in transcriptome profiles have to be taken into account when modelling liver hepatocytes with cultured HepG2 cells.

PCR analysis of the expression of chromosome 18 genes in human liver tissue: interindividual variability

“…клеток, например, для гена DSG3) до 725 (для гена TTR, кодирующего транспортный белок транстиретин, секретируемый печенью). Не было детектировано (на уровне чувствительности проведённого ПЦР-анализа) транскриптов для 16 генов, из которых 7 генов не были детектированы и в предыдущем исследовании [3], где был использован объединённый образец ткани печени от четырёх доноров. Из 12 генов, транскрипты которых не были обнаружены ранее в суммарном образце печени (дополнительные материалы, табл.…”

“…Из 12 генов, транскрипты которых не были обнаружены ранее в суммарном образце печени (дополнительные материалы, табл. S1, ссылка [3]), три транскрипта (продукты генов TCF4, CDH20 и DSG3) детектировали у одного или двух доноров на низком уровне (не более 0,0043 копий кДНК на клетку: дополнительные материалы, табл. S1), а остальные 4 транскрипта хоть и детектировали у всех доноров, но также на довольно низком уровне (0,034 и менее копии кДНК на клетку).…”

“…В рамках этого метода полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводится в формате либо ПЦР в реальном времени (ПЦРрв), либо цифровой капельной ПЦР (цкПЦР). В последнем случае становится возможным определять абсолютное число копий комплементарной ДНК (кДНК) без построения калибровочных прямых с использованием РНК-или ДНК-стандартов [3,4]. В сравнении с современными методами секвенирования транскриптома (RNA-seq), метод ОТ-кПЦР не требует установления порога отсечения, выбор величины которого во многом субъективен [5].…”

“…Таким образом, применительно к ограниченной части транскриптома, такой как транскриптом Хр18, использование метода ОТ-кПЦР с целью количественного профилирования представляется технически возможным. Данный набор был ранее использован для ПЦР-анализа корреляции между абсолютным числом копий транскриптов, кодируемых на Хр18, в клетках культивируемой гепатобластомы человека HepG2 и гепатоцитах печени, а также дифференциальной экспрессии генов Хр18 на уровне транскриптома в этих объектах [3]. На примере транскриптома Хр18 было показано существенное различие в экспрессии генов в ткани печени человека и в клетках линии HepG2, что должно приниматься во внимание при использовании последней в качестве модели для исследования процессов биотрансформации [13].…”

The “Missing” Proteome: Undetected Proteins, Not-Translated Transcripts, and Untranscribed Genes

“…Indeed, the transcriptome profiling of the same sample of human liver, which was used for the proteome analysis, has revealed transcripts of 228 and 260 genes of Chr18 using the RNA-seq analysis and the quantitative polymerase chain reaction (qPCR) in real time, respectively. 5,6,8,9,13 In the RNA-seq analysis, the confidence of detection for a given transcript depends on a cutoff level of reads per kilobase of transcript per million mapped reads (RPKM). For instance, by setting the cutoff level as RPKM > 1, the number of detected transcripts in the human liver was reduced to 157 (for HepG2 cells, from 213 to 151).…”