Pathway and mechanism of tubulin folding mediated by TRiC/CCT conjugated with its ATPase cycle revealed by cryo-EM

Abstract

The eukaryotic chaperonin TRiC/CCT assists the folding of about 10% of cytosolic proteins through an ATP-driven conformational cycle, and the essential cytoskeleton protein tubulin is the obligate substrate of TRiC. Here, we present an ensemble of cryo-EM structures of human TRiC throughout its ATPase cycle, with three of them revealing endogenously engaged tubulin in different folding stages. Our structural and XL-MS analyses suggested a gradual upward translocation and stabilization of tubulin within the TRiC chamber accompanying TRiC ring closure. Remarkably, in the closed TRiC-tubulin-S3 map resolved to 3.1-A-resolution, we captured a near-natively folded tubulin. We found the near-natively folded tubulin engaging through its N and C domains mainly with the A and I domains of the CCT3/6/8 subunits through electrostatic and hydrophilic interactions, while the tubulin I domain was found to remain dynamic. Moreover, we also showed the potential role of TRiC C-terminal tails in substrate stabilization and folding. Our study delineates the pathway and molecular mechanism of TRiC-mediated tubulin folding conjugated with TRiC ATPase cycle, and may also inform the design of therapeutic agents targeting TRiC-tubulin interactions.

Cryo-EM structure of bovine chaperonin TRiC/CCT in open conformation

“…Для построения атомной модели в качестве исходных данных использовалась ранее опубликованная структура человеческого TRiC [27], построенная с помощью криоЭМ-карты плотности с разрешением 3,1 Å (PDB: 7X7Y). Аминокислотная последовательность в этой модели была изменена для соответствия бычьему варианту TRiC.…”

“…В опубликованных работах, посвященных исследованиям структуры TRiC методом криоЭМ, значительно различаются условия получения необходимого образца. В частности, концентрации глицерина в образцах варьируются от 5 до 20% [27,37], а концентрации соли -от 50 до 150 мМ [25,37]. Для уменьшения эффектов денатурации и агрегации TRiC при работе метом криоЭМ необходим тщательный подбор состава образцов, поэтому на первом этапе работы мы сравнили температурную стабильность белка для следующих проб:…”

“…К настоящему времени методом криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) было получено несколько структур эндогенного TRiC из разных организмов и на разных стадиях функционального цикла. Наилучшее разрешение удалось получить для комплексов в закрытой конформации: 2,99 Å -для дрожжевого [25], 4 Å -для бычьего [26] и 3,1 Å -для TRiC из клеточной линии HEK293F [27]. Асимметричность комплекса и его конформационная подвижность являются лимитирующими факторами для получения структур открытой конформации с высоким разрешением.…”