P-TEFb- the final frontier

Kohoutek, Jiří

doi:10.1186/1747-1028-4-19

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“…C forms a high-molecularweight complex including the positive elongation factor b (P-TEFb; heterodimer of CDK9 and CCNT1/2) and several histone-modifying enzymes. 13 P-TEFb is usually stored in 'large complexes' consisting of HEXIM1, 7SK-RNA, MEPCE and LARP7, 19 and is liberated in the presence of AF4 family members or the AF4-MLL . N/MLL .…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

The heterodimerization domains of MLL—FYRN and FYRC—are potential target structures in t(4;11) leukemia

et al. 2011

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The chromosomal translocation t(4;11)(q21;q23) is a frequent genetic aberration of the mixed lineage leukemia (MLL) gene, predominantly associated with high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL) in pediatric patients. Previous studies demonstrated that mice transplanted with hematopoietic cells expressing the AF4-MLL fusion protein develop proB ALL. The AF4-MLL oncoprotein becomes activated by Taspase1-mediated hydrolysis, which subsequently leads to a heterodimer of the cleavage products AF4-MLL . N and MLL . C. This proteinprotein interaction is due to the FYRN and FYRC interaction domains present in both protein fragments. Heterodimerization subsequently induces high-molecular-weight protein complex formation that is protected against SIAH1/2-mediated polyubiquitinylation. Here, we attempted to selectively block this initial heterodimerization step, aiming to prevent the oncogenic activation of the AF4-MLL multiprotein complex. The minimal interaction interface was experimentally defined first in a bacterial two-hybrid system, and then in mammalian cells by using a biosensor assay. Expression of the FYRC domain, or smaller portions thereof, resulted in the inhibition of heterodimer formation, and blocked AF4-MLL multiprotein complex formation with subsequent destruction of the AF4-MLL oncoprotein. Thus, it is in principle possible to specifically target the AF4-MLL protein. This knowledge can now be exploited to design inhibitory decoys in order to destroy the AF4-MLL oncoprotein.

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Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

The heterodimerization domains of MLL—FYRN and FYRC—are potential target structures in t(4;11) leukemia

et al. 2011

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“…64 However, phosphorylation of CDK9 at this same residue, Thr186 and other residues is required for full enzymatic activity at promoters. [64][65][66][67][68][69] These studies suggest dynamic cycles of phosphorylation and dephosphorylation regulate P-TEFb activity to control the release of the RNA Pol II into productive elongation.…”

Section: Acknowledgmentsmentioning

confidence: 99%

Enforcing the pause: Transcription factor Sp3 limits productive elongation by RNA polymerase II

Valín

Gill²

2013

Cell Cycle

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Abbreviations: CDK, cyclin-dependent kinase; CTD, C-terminal domain of the RNA polymerase II; DSIF, DRB sensitivity-inducing factor; H3K4me3, histone H3 trimethylated at lysine 4; H3K36me3, histone H3 trimethylated at lysine 36; H3S10, histone H3 serine 10; NELF, negative elongation factor complex; P-TEFb, positive transcription elongation factor b; PP, protein phosphatase; p21 CIP1 , cyclin-dependent kinase inhibitor 1A; RNA Pol II, RNA polymerase II; SUMO, small ubiquitin-related modifier T he transition of paused RNA polymerase II into productive elongation is a highly dynamic process that serves to fine-tune gene expression in response to changing cellular environments. We have recently reported that the transcription factor Sp3 inhibits the transition of paused RNA Pol II to productive elongation at the promoter of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 CIP1 and other Sp3-repressed genes. Our studies support the view that Sp3 has three modes of action: activation, SUMO-Sp3-mediated heterochromatin silencing and SUMOindependent inhibition of elongation. At the p21 CIP1 promoter, binding of the positive elongation factor P-TEFb kinase was not affected by Sp3. In contrast, Sp3 promoted binding of the protein phosphatase PP1 to the p21 CIP1 promoter, suggesting that Sp3-dependent regulation of the local balance between kinase and phosphatase activities may contribute to gene expression. Our findings show that the transition of paused RNA Pol II to productive elongation is an important step regulated by both promoter-specific activators and repressors to finely modulate mRNA expression levels.

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“…Considerando-se que um complexo P-TEFb contém um dos quatro diferentes tipos de ciclina (T1, T2a, T2b e K) associado a uma das duas isoformas da CDK9 (42 ou 55 kDa), a análise combinatória simples fornece 8 potenciais heterodímeros distintos (KOHOUTEK, 2009). A rigor, cada um destes complexos deve funcionar de modo independente, atuando sobre um subconjunto particular dos genes que são regulados pelo P-TEFb.…”

Section: Genética Da Cdk9unclassified

“…A estrutura cristalográfica do complexo Tat/P-TEFb só pôde ser elucidada recentemente (TAHIROV et al, 2010 (FUJINAGA et al, 1998;TAUBE et al, 2002;LIN et al, 2002). Hoje são conhecidos diversos exemplos de especialização entre os diferentes heterodímeros CDK9/ciclina, aos quais temos nos referido indistintamente como P-TEFb.Considerando-se que um complexo P-TEFb contém um dos quatro diferentes tipos de ciclina (T1, T2a, T2b e K) associado a uma das duas isoformas da CDK9 (42 ou 55 kDa), a análise combinatória simples fornece 8 potenciais heterodímeros distintos (KOHOUTEK, 2009 (RADHAKRISHNAN et al, 2006). Embora a CDK9 deva se auto-fosforilar com a formação do P-TEFb, seu recrutamento ao complexo de transcrição requer a desfosforilação prévia da Thr186 (representada pela etapa XXII).…”

unclassified

“…Considerando-se que um complexo P-TEFb contém um dos quatro diferentes tipos de ciclina (T1, T2a, T2b e K) associado a uma das duas isoformas da CDK9 (42 ou 55 kDa), a análise combinatória simples fornece 8 potenciais heterodímeros distintos (KOHOUTEK, 2009 (RADHAKRISHNAN et al, 2006). Embora a CDK9 deva se auto-fosforilar com a formação do P-TEFb, seu recrutamento ao complexo de transcrição requer a desfosforilação prévia da Thr186 (representada pela etapa XXII).…”

unclassified

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Obtenção das quinases dependentes de ciclinas CDK9 e CDK11 humanas utilizando um sistema bacteriano de expressão (E. coli)

Santos¹

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Exemplar revisadoO exemplar original encontra-se em acervo reservado na Biblioteca do IQSC-USP São Carlos 2015 DEDICATÓRIADedico este trabalho à minha mãe, Tina, e ao meu avô, Newton, que com seu amor, paciência, e apoio incondicionais tornaram tudo possível. AGRADECIMENTOS• À minha orientadora, Prof.ª Fernanda Canduri, pela oportunidade de trabalho, paciência, e confiança em mim depositada.• A todos os colegas do meu grupo e de outros grupos de pesquisa, que contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente à Cíntia, Bruna, Nathália, Juliana, Buana e Reetesh pela ajuda e troca de experiências.• À minha família, por todo o incentivo e apoio com os quais sempre pude contar.• Aos amigos queridos que, de perto ou de longe, estiveram ao meu lado em todos os momentos da jornada.• Às agências de fomento CNPq e Fapesp, pela bolsa de auxílio e financiamento do projeto de pesquisa, respectivamente. EPÍGRAFE"Não foi sem intenção que a engenhosa Natureza uniu a doçura do mel ao ferrão da abelha"− Baltasar Gracián, A Arte da Prudência, século XVII. RESUMOAs CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV). O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga.Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano. of canc...

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P-TEFb- the final frontier

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