Orientation of the OmpF Porin in Planar Lipid Bilayers

Abstract

The outer-membrane protein OmpF is an abundant trimeric general diffusion porin that plays a central role in the transport of antibiotics and colicins across the outer membrane of E. coli. Individual OmpF trimers in planar lipid bilayers (PLBs) show one of two current-voltage asymmetries, thus implying that insertion occurs with either the periplasmic or the extracellular end first. A method for establishing the orientation of OmpF in PLB was developed, based on targeted covalent modification with membrane-impermeant reagents of peripheral cysteine residues introduced near the periplasmic or the extracellular entrance. By correlating the results of the modification experiments with measurements of current asymmetry or the sidedness of binding of the antibiotic enrofloxacin, OmpF orientation could be quickly determined in subsequent experiments under a variety of conditions. Our work will allow the precise interpretation of past and future studies of antibiotic permeation and protein translocation through OmpF and related porins.

Aberrantly Large Single-Channel Conductance of Polyhistidine Arm-Containing Protein Nanopores

“…This finding is in agreement with other OM proteins, such as the monomeric mammalian VDAC 66 and trimeric maltoporin (LamB) 67 of E. coli , which feature unidirectional insertion into a lipid bilayer. On the contrary, there are other OM proteins, including the monomeric OmpG 68 and trimeric OM protein F (OmpF) 69 of E. coli , which insert into a lipid bilayer with no preferred orientation.…”

Permeation von kleinen Molekülen durch Membrankanäle: Chemische Modifikation zur Quantifizierung des Transports über OmpF

“…Zusätzlich erlaubt OmpF das Eindringen von Antibiotika. [11][12][13][14][15][16] Um Tr anslokation des Moleküls von der Kanalbindung zu unterscheiden, haben wir einen molekularen Zähler auf der periplasmatischen Seite platziert. Vond er extrazellularen Seite falten sich lange Schleifen, die die benachbarten b-Faltblätter verbinden.…”

“…[13,14] (n > 20). Asymmetrisches Stromverhalten wurde sowohl bei den beiden chemisch modifiziertem Porinen Omp-F E181C MTSES und OmpF E181C GLTwie auch bei OmpFwt beobachtet.…”

“…[11] Biophysikalische Untersuchungen von rekonstituiertem gereinigtem OmpF in künstlichen Lipiddoppelschichten veranschaulichen die Kationenselektivitätu nd die Beschränkung der Molekülpermeation auf weniger als 600 Da. [11][12][13][14][15][16] Um Tr anslokation des Moleküls von der Kanalbindung zu unterscheiden, haben wir einen molekularen Zähler auf der periplasmatischen Seite platziert. AufE inzelmolekülebene stellen wir fest, ob der Analyt die CR überqueren und den Kanalausgang erreichen kann.…”

“…Asymmetrisches Stromverhalten wurde sowohl bei den beiden chemisch modifiziertem Porinen Omp-F E181C MTSES und OmpF E181C GLTwie auch bei OmpFwt beobachtet. [13,14] (n > 20). Wirb eobachten bei negativen Polaritäten (Abbildung S2 in den Hintergrundinformationen) ein hçheres Ionenstromrauschen.…”