Open Tubular Lab-On-Column/Mass Spectrometry for Targeted Proteomics of Nanogram Sample Amounts

Abstract

A novel open tubular nanoproteomic platform featuring accelerated on-line protein digestion and high-resolution nano liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) has been developed. The platform features very narrow open tubular columns, and is hence particularly suited for limited sample amounts. For enzymatic digestion of proteins, samples are passed through a 20 µm inner diameter (ID) trypsin + endoproteinase Lys-C immobilized open tubular enzyme reactor (OTER). Resulting peptides are subsequently trapped on a monolithic pre-column and transferred on-line to a 10 µm ID porous layer open tubular (PLOT) liquid chromatography LC separation column. Wnt/ß-catenein signaling pathway (Wnt-pathway) proteins of potentially diagnostic value were digested+detected in targeted-MS/MS mode in small cell samples and tumor tissues within 120 minutes. For example, a potential biomarker Axin1 was identifiable in just 10 ng of sample (protein extract of ∼1,000 HCT15 colon cancer cells). In comprehensive mode, the current OTER-PLOT set-up could be used to identify approximately 1500 proteins in HCT15 cells using a relatively short digestion+detection cycle (240 minutes), outperforming previously reported on-line digestion/separation systems. The platform is fully automated utilizing common commercial instrumentation and parts, while the reactor and columns are simple to produce and have low carry-over. These initial results point to automated solutions for fast and very sensitive MS based proteomics, especially for samples of limited size.

Open tubular capillary column for the separation of cytochrome C tryptic digest in capillary electrochromatography

“…Digestion of proteins into MS-friendly peptides is generally carried out and subsequent analysis is done by LC-MS, which is one of the best techniques for proteomics, and it requires the development of high resolution LC columns to separate as many peptides as possible [3]. Monolithic columns [4], columns based on fused core particles [5], and UHPLC columns [6][7][8] are some examples of novel chromatographic approaches of attracted interest.…”

Novas estratégias de preparo de amostras complexas para a determinação de sulfonamidas

“…OT têm um consumo extremamente baixo de solventes, e permite maior sensibilidade ao usar espectrometria de massas por ionização por electrospray (ESI-MS) (93). OT colunas têm recebido atenção devido à sua bem sucedida cromatografia de compostos de elevada massa molecular, tais como proteínas e peptídeos com alta capacidade de pico em sistemas de alta sensibilidade nano-LC tandem MS (MS / MS) (32,92,94,95,96,97). No entanto, as colunas do tipo OT estão associadas a uma fraca retenção e é praticamente não favorável para a análise de moléculas pequenas, o que está muito mais associado a colunas maiores e de alta capacidade.…”

“…Para permitir a injeção de μL de amostras (isto é, capacidade superior) em colunas OT, pode ser utilizada a SPE em linha. Apenas um número limitado de estudos exploraram variantes de coluna SPE para acoplamento OT (32,33,92,94,95,96,97,100,101).…”

“…Um capilar de sílica fundida de 10 µm de id e 2 m de comprimento foi pré-tratado e silanizado conforme descrito anteriormente (99 A melhor composição para obter uma coluna PS-OD-DVB foi a de 2,5% de estireno, 2,5% de 1-octadeceno, 5% de DVB, 75% de 1-decanol e 15% de DMF.…”

“…1% em peso de AIBN em relação aos monômeros e 16 horas de polimerização a 74 ° C. O comprimento do capilar para a polimerização foi de 20 cm. AFFL permitiu uma análise muito robusta usando colunas LC de capilaridade maior / nano para uma gama de aplicações (99,107,110). No entanto, se um dos buracos da mPLOT SPE estivessem entupidos, então ainda haveria 83 canais totalmente operacionais.…”