Obtenção de mutantes de Aspergillus carbonarius via transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens

Abstract

ResumoAspergillus carbonarius é um potente produtor de ocratoxina A, uma toxina que apresenta efeitos nefrotóxico e carcinogênico. O conhecimento de genes envolvidos em sua biossíntese pode contribuir para o desenvolvimento de medidas de controle. O método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens tem sido demonstrado como uma importante ferramenta para a obtenção de mutantes insercionais visando à caracterização de novos genes. O objetivo deste trabalho foi adequar o método de transformação genética via A. tumefaciens para a linhagem ITAL187 de A. carbonarius e obter mutantes alterados para a produção de ocratoxina A. Conídios foram transformados para resistência a higromicina B usando a linhagem AGL-1 de A. tumefaciens. A freqüência média de transformação foi de 20,04 transformantes por 10 5 conídios-alvo. A prova física da transformação foi obtida pela detecção do gene hph por PCR e Southern Blot. Esta última demonstrou que a integração do DNA exógeno ocorreu de forma aleatória no genoma fúngico. Dentre 238 transformantes, 12 (5,042%) mostraram variações morfológicas. Três mutantes (T44, T47 e T188) com significativa redução e dois mutantes (T238 e T162) com aumento da capacidade de produção de ocratoxina A foram obtidos. A identificação dos genes nocauteados contribuirá para a compreensão da biossíntese desta toxina. Palavras-chave: Aspergillus carbonarius. Ocratoxina A. Agrobacterium tumefaciens. Transformação genética. Mutantes insercionais. AbstractAspergillus carbonarius is a potent ochratoxin A producer, a mycotoxin that has nephrotoxic and carcinogenic effects. The knowledge of genes involved in biosynthesis of this toxin may be useful for the development of detection and control methods. The Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method has been demonstrated as a powerful tool to obtain insertional mutants for the characterization of new genes. The aim of this work was to adapt the A. tumefaciens-mediated transformation method for ITAL187 strain of A. carbonarius and to obtain transformants with alteration in ochratoxin A production. Conidia were transformed to hygromicin B resistance using AGL-1 strain of A. tumefaciens. The transformation frequency was 20,04 transformants per 10 5 target conidia. The transformation evidence was obtained by PCR and Southern Blot analysis. The last one showed us that 1 Bolsista PIBIC/CNPq/UEL -UEL

Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium proliferatum

“…The observed mitotic stability (95%) of these transformants was high, and they retained the ability to grow on hygromycin B after five generations on non-selective medium, similar to the mitotically stable transformants of other species of fungi transformed via A. tumefaciens (Fitzgerald et al, 2003;Ando et al, 2009;Figueiredo et al, 2010). The expression of the hygromycin B resistance gene was confirmed by PCR in all the transformants and was performed as described in Lunardi et al (2006).…”

Identification of a splicing coactivator gene that affects the production of ochratoxin a in Aspergillus carbonarius

“…Bundock et al (1995) firstly described the protocols for the transference of T-DNA into fungi cells. Only recently, the Agrobacterium-mediated transformation (AMT) protocol was adapted to transform A. carbonarius and used for generating insertional mutants Lunardi et al, 2006). In this contribution, we verified the integration of T-DNA in one A. carbonarius ochratoxindefective mutant obtained by AMT, and identified a gene which was probably involved in the regulation of OTA biosynthesis.…”

“…The mutant T188 was obtained by using Agrobactrium-mediated transformation approach by Lunardi et al (2006). This mutant produces significantly lower amounts of OTA than the wild type strain after growing for four days on YES medium.…”