NTPDase2 de Leishmania (Viannia) braziliensis: expressão heteróloga, caracterização bioquímica e análise de inibidores derivados da quercetina

Abstract

Leishmania (Viannia) braziliensis é o principal causador da Leishmaniose Tegumentar Americana. Os tratamentos não são sempre efetivos e apresentam efeitos adversos, sendo necessário o desenvolvimento de novas terapias. Correlação entre atividade ectonucleotidásica e virulência, em diferentes espécies de Leishmania, apontam para a importância das NTPDases como fatores de virulência do parasito. Neste trabalho, estudamos as variantes para rLbNTPDase2 dos isolados ET e NSL de L. (V.) braziliensis, com o objetivo de avaliar se diferenças bioquímicas podem estar relacionadas a diferenças na virulência desses isolados e avaliamos o potencial de inibição da rET-NTPDase2 por compostos derivados da quercetina. A sequência do ectodomínio (S43-E425) foi expressa em sistema bacteriano e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a níquel. Nossos resultados mostram que as enzimas possuem 5 regiões conservadas de apirase (ACRs). As 4 mutações de rNSL-NTPDase-2 estão fora das ACRs e a mutação Q99P se localiza dentro do domínio B (R82-Y121), região antigênica conservada. Após expressão e purificação, foram identificadas bandas preditas de 45 KDa. Os resultados de atividade enzimática mostram que ambas são genuínas ENTPDases, pois hidrolisam nucleotídeos tri e difosfatados, mas não AMP. O perfil geral de hidrólise foi UDP>GDP>ADP>ATP=UTP para rET-NTPDase2 e GDP=UDP>ADP=ATP=UTP para rNSL-NTPDase2, sendo ambas difosfatases. rNSL- NTPDase2 apresenta maior taxa de hidrólise NTP:NDP, sugerindo que as mutações possam direcionar uma maior hidrólise de nucleotídeos trifosfatados. Adicionalmente, rNSL- NTPDase2 apresenta maior hidrólise de ATP, o que pode explicar, pelo menos parcialmente, sua maior virulência. Continuamos os ensaios de caracterização com a enzima rET-NTPDase2 e avaliamos o potencial de inibição de compostos derivados da quercetina. Nossos resultados mostram que a enzima foi inibida por suramina e DIDS, inibidores de outras ENTPDases. Altos valores de K m para ATP, ADP e UDP sugerem improvável atuação na desativação de receptores purinérgicos. Contudo, sugerimos que a enzima tenha importância em situações específicas de alta concentração de nucleotídeos ou no ambiente intracelular. Dois compostos, IL-09 e IL-05, inibiram a atividade enzimática em 92,88% e 88,41% com excesso de substrato. Baixo valor de IC 50 para o IL-09 (6.56 µM), indica uma alta afinidade do composto com a enzima, ideia reforçada pela cinética enzimática na presença de IL-09, que indica um perfil de inibição do tipo misto. Sua composição química sugere que a presença de benzilas nos grupamentos fenólicos possa ser determinante para a alta afinidade de interação do composto. Esperamos que este estudo possa contribuir para o entendimento das NTPDases em L. braziliensis e auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos para tratamento da leishmaniose tegumentar. Palavras-chave: Leishmania braziliensis. Nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase-2. Bioquímica. Quercetina.