Multiplex Picoliter-Droplet Digital PCR for Quantitative Assessment of DNA Integrity in Clinical Samples

Didelot, Audrey; Kotsopoulos, Steve K.; Lupo, Audrey; Pekin, Deniz; Li, Xinyu; Atochin, Ivan; Srinivasan, Preethi; Zhong, Qun; Olson, Jeff; Link, Darren R.; Laurent‐Puig, Pierre; Blons, Hélène; Hutchison, J. Brian; Taly, Valérie

doi:10.1373/clinchem.2012.193409

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“…Sequence artifacts in FFPE DNA are observed more frequently as the number of input DNA templates decreases (53 ). The fewer amplifiable templates that are used in molecular analysis, the more chance that DNA templates with lesions leading to subsequent sequencing errors will be de- (30 ). The PCR success rate of FFPE DNA is strongly correlated with the size of the amplicon (49,54 ), confirming the benefit of designing shorter amplicons.…”

Section: Using Short Ampliconsmentioning

confidence: 84%

“…Compared to DNA from fresh formalin-fixed tissues, the PCR success rate of DNA from older formalin-fixed tissues was shown to be decreased (29 ), indicating that DNA fragmentation may continuously occur during storage. Fragmentation damage in FFPE DNA directly influences the amount of templates available for PCR amplification (30 ). Thus, the same quantity of FFPE DNA from different samples may contain significantly different amounts of amplifiable templates, depending on the degree of fragmentation damage (6 ).…”

Section: Dna Fragmentationmentioning

confidence: 99%

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Sequence Artifacts in DNA from Formalin-Fixed Tissues: Causes and Strategies for Minimization

2015

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BACKGROUND: Precision medicine is dependent on identifying actionable mutations in tumors. Accurate detection of mutations is often problematic in formalinfixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. DNA extracted from formalin-fixed tissues is fragmented and also contains DNA lesions that are the sources of sequence artifacts. Sequence artifacts can be difficult to distinguish from true mutations, especially in the context of tumor heterogeneity, and are an increasing interpretive problem in this era of massively parallel sequencing. Understanding of the sources of sequence artifacts in FFPE tissues and implementation of preventative strategies are critical to improve the accurate detection of actionable mutations.CONTENT: This mini-review focuses on DNA template lesions in FFPE tissues as the source of sequence artifacts in molecular analysis. In particular, fragmentation, base modification (including uracil and thymine deriving from cytosine deamination), and abasic sites are discussed as indirect or direct sources of sequence artifacts. We discuss strategies that can be implemented to minimize sequence artifacts and to distinguish true mutations from sequence artifacts. These strategies are applicable for the detection of actionable mutations in both single amplicon and massively parallel amplicon sequencing approaches.

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Section: Using Short Ampliconsmentioning

confidence: 84%

Section: Dna Fragmentationmentioning

confidence: 99%

Sequence Artifacts in DNA from Formalin-Fixed Tissues: Causes and Strategies for Minimization

2015

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“…The theoretical fraction of positive droplets was estimated as previously described (27,28), and a Poisson distribution of genomic DNA was expected in the droplets.…”

Section: Determination Of the Amount Of Amplifiable Dnamentioning

confidence: 99%

“…In ddPCR, individual DNA fragments are compartmentalized into more than a million droplets, which are then amplified in parallel. By using this system, the detection of one KRAS mutant among 200,000 KRAS wild-types has been demonstrated for genomic DNA from tumor cell lines (25), and this technologic advantage in highly sensitive mutation detection has been adopted in clinical research as well (26)(27)(28)(29)(30).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Ultra-Sensitive Detection of the Pretreatment EGFR T790M Mutation in Non–Small Cell Lung Cancer Patients with an EGFR-Activating Mutation Using Droplet Digital PCR

Watanabe

Kawaguchi

Isa

et al. 2015

Clinical Cancer Research

201

173

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Purpose: The resistance to the EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI) is a major concern in non-small cell lung cancer (NSCLC) treatment. T790M mutation in EGFR accounts for nearly 50% of the acquired resistance to EGFR-TKIs. Earlier studies suggested that T790M mutation was also detected in TKI-na€ ve NSCLCs in a small cohort. Here, we use an ultra-sensitive droplet digital PCR (ddPCR) technique to address the incidence and clinical significance of pretreatment T790M in a larger cohort.Experimental Design: ddPCR was established as follows: wildtype or T790M mutation-containing DNA fragments were cloned into plasmids. Candidate threshold was identified using wild-type plasmid, normal human genomic DNA, and human A549 cell line DNA, which expresses wild type. Surgically resected tumor tissues from 373 NSCLC patients with EGFR-activating mutations were then examined for the presence of T790M using ddPCR.Results: Our data revealed a linear performance for this ddPCR method (R 2 ¼ 0.998) with an analytical sensitivity of approximately 0.001%. The overall incidence of the pretreatment T790M mutation was 79.9% (298/373), and the frequency ranged from 0.009% to 26.9%. The T790M mutation was detected more frequently in patients with a larger tumor size (P ¼ 0.019) and those with common EGFRactivating mutations (P ¼ 0.022), as compared with the others.Conclusions: The ultra-sensitive ddPCR assay revealed that pretreatment T790M was found in the majority of NSCLC patients with EGFR-activating mutations. ddPCR should be utilized for detailed assessment of the impact of the low frequency pretreatment T790M mutation on treatment with EGFR-TKIs. Clin Cancer Res; 21(15); 3552-60. Ó2015 AACR.

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“…Elle permet à la fois de réali-ser plus efficacement les tests réalisés aujourd'hui par des méthodes telles que la qPCR, mais également de réaliser des expériences au-delà des capacités des procédures conventionnelles. Il est cependant à noter que de nouvelles procédures, plus sensibles que les procédures conventionnelles, basées sur la PCR quantitative spécifique d'allèles, ont été récemment développées pour l'analyse d'ADN libre tumoral circulant [23,24] et validées dans le cadre d'études cliniques [19]. Ainsi, la dPCR est particulièremente pertinente pour la détection et la quantification de marqueurs minoritaires, incluant les sousclones rares au sein de la tumeur ou de l'ADN libre circulant.…”

Section: Caractérisation Des Altérations Génétiquesunclassified

PCR digitale en micro-compartiments

et al. 2015

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> La recherche d'altérations génétiques dans les cellules tumorales fait partie de la prise en charge des patients atteints de cancer. L'analyse de l'ADN libre tumoral circulant dans les fluides biologiques, dont le sang, pourrait permettre le dépistage précoce de la maladie, la gestion thérapeutique des patients et la détection de récidives. Cet ADN libre tumoral, décrit comme représentatif de l'hétérogénéité tumorale, peut être retrouvé dans le sang dans des proportions faibles et variables selon la nature et la progression de la tumeur. Son analyse nécessite des méthodes à la fois très sensibles, spécifiques et quantitatives. Ces exigences représentaient une limite technologique que les récentes avancées de la PCR (polymerase chain reaction) digitale devraient permettre de dépasser. < tumeurs à l'échelle moléculaire, sont particulièrement pertinents dans le domaine de la médecine de précision. En effet, de nombreux traitements ciblés ont été développés ces dix dernières années, et de nouveaux marqueurs de sensibilité ou de résistance à ces traitements mis en évidence. Le suivi au cours du temps de ces altérations génétiques permettrait de suivre l'évolution du cancer, l'efficacité d'un traitement ou de détecter une éventuelle récidive. L'utilisation pleinement efficace de ces marqueurs en oncologie clinique nécessite cependant des méthodes précises et fiables pour les détecter dans différents types d'échantillons (biopsies tumorales, fluides biologiques dont le sang). L'avancée technologique récente que représente la PCR (polymerase chain reaction) digitale (dPCR) en microcompartiments permet la détection et la quantification de séquences rares avec une sensibilité et une précision hors de portée des procédures conventionnelles [43] (➜). La dPCR a ainsi récemment émergé comme un outil extrêmement prometteur pour le suivi non invasif de marqueurs géné-tiques, particulièrement pertinent pour la recherche en cancérologie. Caractéristiques de l'ADN libre circulant et contraintes liées à sa mesureDes acides nucléiques sont retrouvés dans l'ensemble des fluides biologiques dont le sang, les urines, les selles, la salive ou le liquide Le développement et la démocratisation des techniques de biologie moléculaire ont permis d'importants progrès dans la détection et l'analyse des acides nucléiques. Ces techniques constituent aujourd'hui un outil clé de la prise en charge des patients atteints de cancer. En effet, des réseaux complexes d'altérations génétiques ont été mis en évidence dans la plupart des cancers. Il peut s'agir, entre autres, de délétions, de mutations ponctuelles, de réarrangements chromosomiques ou d'amplifications. Ces altérations génétiques étant présentes uniquement dans les cellules tumorales, elles représentent des marqueurs spécifiques de cancer. Ces marqueurs peuvent être classés en trois grandes catégories : il peut s'agir de marqueurs diagnostiques, permettant, par exemple, de déterminer la localisation de la maladie ou son stade ; de marqueurs pronostiques, permettant de détecter la progressi...

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Multiplex Picoliter-Droplet Digital PCR for Quantitative Assessment of DNA Integrity in Clinical Samples

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Sequence Artifacts in DNA from Formalin-Fixed Tissues: Causes and Strategies for Minimization

Sequence Artifacts in DNA from Formalin-Fixed Tissues: Causes and Strategies for Minimization

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PCR digitale en micro-compartiments

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