Η υπεροικογένεια του TGFβ περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι παίζουν σημαντικό ρόλο σε πλειάδα λειτουργιών σε κυτταρικό, ιστικό και οργανισμικό επίπεδο. Σημαντικό συστατικό της μεταγωγής του σήματος όλων των μελών της υπεροικογένειας αυτής αποτελεί η κοινή SMAD4 (co-SMAD), η οποία ολιγομερίζεται με τις SMAD πρωτεΐνες οι οποίες φωσφορυλιώνονται από τους υποδοχείς (R-SMADs). Στη διατριβή αυτή εστιάσαμε την προσοχή μας σε μια πρώτη παρατήρηση, σε συνεργασία με τον Δρ. Philippe Chavrier, όπου η SMAD4 βρέθηκε να συνδέεται με την ARF6 στο σύστημα δύο υβριδίων σε ζυμομύκητα. Αρχικά, η αλληλεπίδραση αυτή επιβεβαιώθηκε βιοχημικά με πειράματα καταβύθισης και συν-ανοσοκατακρήμνισης από τα οποία προέκυψε ότι μεταξύ των τριών μορφών της ARF6 (φυσικού τύπου WT, μόνιμα ενεργής Q67L και μόνιμα ανενεργής Τ27Ν), οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν, μόνο η μόνιμα ενεργή μορφή της ARF6 αλληλεπιδρά με την SMAD4. Επιπροσθέτως, με πειράματα καταβύθισης σε 293 κύτταρα, δείχθηκε ότι η σύνδεση ARF6Q67L-SMAD4 είναι ειδική: δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση της SMAD4 με καμιά από τις ενεργές μορφές των ARF1 (ARF1Q71L) και ARF5 (ARF5Q71L) εκπροσώπων των τάξης I και II, των ARF GTPασών αντίστοιχα. Ακολούθως διερευνήθηκε η πιθανή φυσική σύνδεση της ARF6 με τις SMAD2/SMAD3 (R-SMADs). Πράγματι, πειράματα καταβύθισης επιβεβαίωσαν τη σύνδεση της ARF6Q67L με τις SMAD2 και SMAD3. Περαιτέρω πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης της ARF6Q67L, με καθεμία από τις SMAD2/3/4, έδειξαν ότι απουσία TGFβ, οι SMAD2/3/4 πρωτεΐνες ανοσοκατακρημνίζονται από την ARF6Q67L, ενώ παρουσία TGFβ, μόνο η SMAD3 ανοσοκατακρημνίζεται. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με την χρήση μόνιμα ενεργοποιημένων SMAD2(EDME) και SMAD3(EDVE), όπου οι καρβοξυτελικές σερίνες που φωσφορυλιώνονται από τον υποδοχέα -SSXS- μεταλλάχθηκαν σε γλουταμινικά και ασπαρτικό, ως -EDME- και -EDVE-. Πράγματι, η ARF6Q67L ανοσοκατακρήμνισε με καλή απόδοση την SMAD3(EDVE), ενώ μόνο οριακά την SMAD2(EDME). Συμπερασματικά, οι μη φωσφορυλιωμένες SMAD2, SMAD3 και SMAD4 (απουσία προσδέματος) συνδέονται με την ARF6Q67L, ενώ παρουσία προσδέματος μόνο η SMAD3-P συνδέεται με την ARF6Q67L. Αμέσως μετά πραγματοποιήθηκαν πειράματα χαρτογράφησης των δομικών περιοχών των SMAD2/3/4 οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη σύνδεση με την ARF6Q67L. Με καταβύθιση εντοπίστηκε η περιοχή της SMAD4 πρωτεΐνης η οποία είναι υπεύθυνη για την φυσική σύνδεση με την μόνιμα ενεργή μορφή της ARF6. Πρόκειται για τα 32-καρβοξυτελικά αμινοξέα της SMAD4 πρωτεΐνης, τα οποία είναι επαρκή για την διαμεσολάβηση της σύνδεσης με την ARF6. Επιπλέον, απάλειψη των 43-καρβοξυτελικών αμινοξέων είχε ως αποτέλεσμα την εξαφάνιση της σύνδεσης με την ARF6Q67L. Παραπέρα πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης ARF6Q67L με κατασκευές των SMAD2 και SMAD3 έδειξαν ότι η ARF6Q67L συνδέεται με τα τελευταία 40 καρβοξυτελικά αμινοξέα της SMAD2, όπως και στην περίπτωση της SMAD4, ενώ η περιοχή σύνδεσης με την SMAD3 βρίσκεται ανοδικά. Επειδή η ARF6Q67L συνδέεται φυσικά με τις SMAD2 και SMAD3 απουσία προσδέματος, ήταν επιβεβλημένο να ελεγχθεί η δυνατότητα η σύνδεση αυτή να μειώνει, λόγω ανταγωνιστικής δέσμευσης, τη διαθεσιμότητα των SMAD2 και SMAD3 πρωτεϊνών προς φωσφορυλίωση από τους ενεργοποιημένους από το πρόσδεμα τύπου I υποδοχείς. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της υπερεκφρασμένης ARF6 (φυσικού τύπου WT, μόνιμα ενεργής Q67L και μόνιμα ανενεργής Τ27Ν) στη φωσφορυλίωση των SMAD2 και SMAD3 από τον TGFβ και την Ακτιβίνη Α. Παρουσία TGFβ, τόσο σε ενδοθηλιακά κύτταρα FIUVEC, όσο και σε εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293, δείχθηκε ότι η ARF6 (και οι τρεις μορφές της) προκαλεί δραματική μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης της SMAD2 σε ποσοστό άνω του 80%. Αναφορικά με την SMAD3, η προκαλούμενη από την ARF6 (και από τις τρεις μορφές της) μείωση της από τον TGFβ προκαλούμενης φωσφορυλίωσής της ήταν επίσης σημαντική, περίπου 40%. Αντίθετα, η ARF6 (και οι τρεις μορφές της) δεν επηρέασε καθόλου την φωσφορυλίωση των SMAD2/SMAD3 από την Ακτιβίνη Α, σε FIUVEC και 293 κύτταρα. Η παντελής έλλειψη αρνητικής επίδρασης της ARF6 στην φωσφορυλίωση των SMAD2 και SMAD3 από την Ακτιβίνη Α υποδεικνύει ότι η σύνδεση της ARF6 με αυτές τις SMAD δεν επηρεάζει την διαθεσιμότητα τους, λόγω ανταγωνιστικής δέσμευσης, προς φωσφορυλίωση από τους ενεργοποιημένους τύπου I υποδοχείς. Παράλληλα όμως, από τα παραπάνω πειράματα εξήχθησαν και αλλά δύο συμπεράσματα. Πρώτο, η αναστολή της φωσφορυλίωσης των SMAD2/3 (μετά από χορήγηση TGFβ) από τις ARF6wt, ARF6Q67L και ARF6T27N πρέπει να οφείλεται στην αναστολή της ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων του TGFβ, διαδικασία η οποία θεωρείται απαραίτητη προκειμένου να ενεργοποιηθούν οι SMAD2/3 στα πρώιμα ενδοσώματα. Αυτή ακριβώς η δραστικότητα της ARF6 επηρεάζεται από τον κύκλο της GTP-GDP μετατροπής της απαιτώντας συνεχείς κύκλους μετατροπής του GTP σε GDP με συνέπεια η μόνιμα ενεργή και η μόνιμα ανενεργή μορφή της ARF6 να έχουν αμφότερες ανασταλτική δραστικότητα στην ενδοκυττάρωση/ανακύκλωση υποδοχέων. Το ίδιο έχει αναφερθεί να συμβαίνει και με την υπερέκφραση της ARF6wt, αν και ο μηχανισμός δεν είναι διευκρινισμένος. Πράγματι, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης ARNO (GEF της ARF6), η οποία ενεργοποιεί την ARF6 χωρίς να ‘κλειδώνει’ την ARF6 στην GTP μορφή, δεν είχε αρνητική επίδραση στη φωσφορυλίωση των SMAD2/3 από τον TGFβ. Δεύτερο, ο μη επηρεασμός της από την Ακτιβίνη Α επαγόμενης φωσφορυλίωσης των SMAD2/3 από τις ARF6wt, ARF6Q67L και ARF6T27N οδηγεί στο συμπέρασμα ότι είτε οι υποδοχείς της Ακτιβίνης Α ενδοκυτταρώνονται με διαδικασίες οι οποίες είναι ARFG-ανεξάρτητες, είτε οι υποδοχείς της Ακτιβίνης Α δεν χρειάζονται ενδοκυττάρωση για να φωσφορυλιώσουν τις SMAD2/3 πρωτεΐνες. Σειρά πειραμάτων μεταγραφικής ρύθμισης οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η φυσική σύνδεση της ARF6 με τις SMAD πρωτεΐνες, αλλά και η επίδρασή της στην φωσφορυλίωσή τους διαμέσου αναστολής της ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων τους, έχει σαν αποτέλεσμα την καταστολή της μεταγραφικής δραστικότητας των SMAD2 και SMAD3. Τέλος δείξαμε ότι όχι μόνο η κατάσταση ενεργοποίησης της ARF6 επηρεάζει την μεταγωγή του σήματος από μέλη της οικογένειας του TGFβ, αλλά και η ενεργοποίηση των καθοδικών μονοπατιών του TGFβ επηρεάζει το επίπεδο ενεργοποίησης της ARF6. Πράγματι, τα πειραματικά μας δεδομένα έδειξαν ότι εντός 20 min ο TGFβ μετατρέπει ένα μεγάλο ποσό της ARF6 στην ανενεργή μορφή της (GDP προσδένουσα). Φαίνεται λοιπόν ότι λόγω της ανασταλτικής δραστικότητας της ARF6-GTP στη SMAD-εξαρτώμενη μεταγραφή, ο TGFβ μεγιστοποιεί την μεταγωγή των σημάτων του μετατρέποντας την ARF6 στην ανενεργή GDP μορφή της. Ανοίγει, λοιπόν, η δυνατότητα παραπέρα μελετών για την λεπτομερέστερη διερεύνηση της αμφίδρομης αλληλεπίδρασης μεταξύ της ARF6 και TGFβ/ακτιβίνης, όπου το ένα σύστημα επηρεάζει τη λειτουργικότητα του άλλου.