Mapeamento das interações proteína-ligante através de técnicas de RMN de ¹H utilizando detecção do ligante

Abstract

Recebido em 11/8/06; aceito em 16/2/07; publicado na web em 29/8/07 SCREENING PROTEIN-LIGAND INTERACTIONS USING 1 H NMR TECHNIQUES FOR DETECTING THE LIGAND. NMR is a valuable screening tool for the binding of ligands to proteins providing structural information on both protein and ligands and is thus largely applied to drug-discovery. Among the recent NMR techniques to probe weak binding protein-ligand complexes we have critically evaluated the advantages and disadvantages of STD (Saturation Transfer Difference), WaterLOGSY (Water Ligand Observation with Gradient Spectroscopy), NOE pumping and DOSY-NOESY (Diffusion-Ordered NOESY) using a mixture of BSA (bovine serum albumin) plus salicylic acid, caffeine, citric acid, adipic acid and D-glucose.Keywords: NMR; protein-ligand interactions; bovine serum albumin. INTRODUÇÃOOs fenômenos físico-químicos desencadeados pelas interações intermoleculares entre ligantes e receptores macromoleculares são a chave para o entendimento dos processos biológicos 1 . Neste contexto, a ressonância magnética nuclear (RMN) tornou-se a priori uma técnica poderosa no estudo de interações proteína-ligante, sendo capaz de detectar e quantificar as interações com alta sensibilidade sem o conhecimento prévio da função da proteína 2 . Entretanto, o monitoramento das interações através dos deslocamentos químicos das macromoléculas é difícil de ser analisado sem marcação isotópica. Isso faz com que o estudo das propriedades dos ligantes seja mais apreciado, pois, fornece espectros de RMN mais simplificados e resolvidos que os espectros das macromoléculas. Existem muitos métodos espectroscópicos para a observação do epitopo dos ligantes, como métodos baseados na relaxação 3 T 2 e transferência de NOE 4 . Entende-se por epitopo a superfície de contato macromolécula-ligante que pode ser mapeada através dos hidrogênios situados na interface. Os principais experimentos utilizados na obtenção do epitopo do ligante são o STD 5,6 ("Saturation Transfer Difference"), WaterLOGSY 7 ("Water Ligand Observation with Gradient Spectroscopy") e NOE pumping 8,9 . Já o experimento de DOSY-NOESY ("Diffusion-Ordered" NOESY) permite a obtenção do epitopo da proteína. Portanto, estas técnicas fornecem informações complementares acerca das interações proteína/ligante.Este trabalho está voltado para o estudo das funções de proteínas através de suas interações com metabólitos celulares e xenobióticos, aplicando-se técnicas de RMN 1 H e de transferência de NOE. O efeito overhauser nuclear (NOE)O NOE (Efeito Overhauser Nuclear) é definido como a mudança na área do sinal proveniente de um núcleo causada pela saturação do sinal de um segundo núcleo. Essa alteração resulta da transferência de polarização entre núcleos acoplados dipolarmente via mecanismos de relaxação spin-rede (T 1 ). Estes experimentos têm a característica de "sondar" acoplamentos dipolares que são espectralmente "invisíveis" nas amostras líquidas, mas fornecem informações relevantes sobre os movimentos moleculares e distâncias intra e intermoleculares.A t...

Estudos estruturais e de interação de novos inibidores e ativadores da tirosinase

“…Moléculas com baixo e médio peso molecular (menor tempo de correlação) apresentam tempos de relaxação maiores, enquanto que moléculas com alto peso molecular (maior tempo de correlação), como proteínas, apresentam tempos de relaxação menores (Diercks, 2001, Figueiredo, 2007. Um gráfico com a relação do tempo de relaxação e o tamanho da molécula pode ser visto na Figura 1.9.…”

“…Um gráfico com a relação do tempo de relaxação e o tamanho da molécula pode ser visto na Figura 1.9. Com base nessa diferença, quando uma molécula pequena se liga a uma molécula com alto peso molecular, como uma proteína, a primeira passa a fazer parte do macrossistema, adotando assim tempos de relaxação também menores (Diercks, 2001, Figueiredo, 2007. Dessa forma, observando-se essa variação nos tempos de relaxação do ligante livre com o ligante na presença da proteína pode-se ter um mapeamento dos átomos do ligante envolvidos em tal interação.…”

“…Além disso, o coeficiente de difusão é muito sensível a mudanças estruturais e aos processos de interação (Souza, 2009;Yan, 2002). Moléculas com alto peso molecular, como as proteínas, apresentam menores valores de coeficiente de difusão, enquanto que moléculas de baixo peso molecular, como alguns ligantes, apresentam maiores valores de coeficiente de difusão (Diercks, 2001, Figueiredo, 2007. Com isso, quando alguns átomos de hidrogênio de um ligante passam a interagir com a proteína, seus coeficientes de difusão variam de maiores valores para menores valores, dando indícios dos átomos envolvidos em tal interação.…”

“…Quando ocorre uma interação entre o ligante e uma proteína, o NOE pode mudar drasticamente. Essa variação é o fundamento de vários experimentos para estudar a interação ligante/proteína (Figueiredo, 2007). Esta mudança no NOE ocorre por transferência de NOE ou NOE transferido (tr-NOE) (Stockman, 2002).…”

“…Moléculas com baixo e médio peso molecular apresentam valores de NOEs positivos, enquanto que moléculas com alto peso molecular, como proteínas/enzimas, apresentam NOEs fortemente negativos (Figura 1.11) (Figueiredo, 2007). Com isso, quando uma molécula pequena se liga a uma molécula com alto peso molecular, como uma proteína, a primeira passa a fazer parte da molécula maior, adotando e variando o NOE para o novo estado: NOE fortemente negativo (Figueiredo, 2007). Esse tr-NOE reflete a interação do ligante com o receptor.…”