La leche de vaca es uno de los alimentos de mayor consumo por su abundante composición de proteínas, ácidos grasos y micronutrientes esenciales. Sin embargo, estas características, aunadas a las medidas higiénicas deficientes en el método de obtención de este producto a través del ordeño manual; así como, su recolección, almacenamiento y transporte, lo hacen susceptible a contaminación por microorganismos y por tanto responsable de enfermedades a nivel gastrointestinal. Objetivo. Identificar bacterias Gram positivas presentes en leche cruda de vaca, obtenida por ordeño manual, provenientes de cinco vaquerías ubicadas en el Cantón de Chilla en la Provincia de El Oro, en Ecuador. Materiales y métodos. Por muestreo aleatorio se obtuvieron 20 muestras de leche, cada una de 150 ml, recolectadas del ordeño manual realizado en cinco vaquerías. Una vez recolectadas las muestras, se aplicó la Normativa INEN1 529-2:99 para el manejo y transporte. Asimismo, se realizó un análisis microbiológico según los protocolos de las normativas NTE INEN9:2012 y NTE INEN 1529-5:2006, en el Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Universidad Técnica de Machala. Para la detección e identificación de las bacterias Gram positivas se aplicaron métodos de dilución, caracterización, prueba bioquímica enzimática y tinción de Gram. Resultados. Las características fisicoquímicas de densidad y pH, de las muestras cumplieron con la Normativa. En todas las muestras, se observó presencia de turbidez, gas y precipitado en las diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000. Las pruebas enzimáticas y el cultivo microbiológico identificaron la presencia de Staphylococcus aureus. Conclusiones. El género Staphylococcus especie aureus fue la bacteria Gram positiva predominante.