Laser-induced tobacco protoplast fusion

Abstract

Laser tweezers can manipulate small particles, such as cells and organelles. When coupling them with laser microbeam selective fusion of two tobacco protoplasts containing some chloroplast was achieved. Physical and biological variables that affect laser trapping and laser-induced fusion were also discussed. The results show that the effect of chloroplast content and distribution on the yield of cell fusion is remarkable.

The Summary of Plant Cell Fusion and Its Application

“…。植物细胞融合又可将各种 细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引 入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为 某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮等提供了可行 的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速 繁殖和有用物质生产等 [3,4] 。 植物细胞融合技术避免了 DNA 的分离、提纯、剪切、拼接等操作，在技术和仪 器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有 利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正 得到科学界的日益重视 [5,6] 。 发展至今， 已从许多种内、 种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系 或杂种植株 [7] 。 现出融合亲本之一胡杨的耐盐特性。林木体细胞杂交 虽然现有的报道不多，但是随着林木原生质体培养的 成功及融合方法、融合方式上的不断改进，林木体细 胞杂交将有着广阔的应用前景 [10] [11] 。作物的一 些重要经济性状，如胞质雄性不育，抗除莠剂阿特拉 津的抗性基因都是由胞质基因控制的，通过原生质体 融合进行细胞质基因重组，是一条可直接用于育种的 简便途径，到目前为止，已有不少成功的例子 [11,12] 。 不对称融合中，施主染色体常丢失，克隆间有较大变 异，X 或 γ 射线量大时，远缘间组合力强。种间融合 的部分杂种植株，在低射线量时，为三倍体，高射线 量为近于五倍体的非整倍体。高射线量时，再分化和 植株生长迟缓，无果实。最适射线量尚未确定 [12] 。有 人认为，用自单倍体植物而来的单倍体细胞、花粉细 胞或异常减数分裂所得到的部分染色体和基因组，应 用于不对称融合中是今后的重要研究课题。 植物原生质体培养的成功是体细胞杂交发展的 先决条件，纵观体细胞杂交的发展过程不难看出，其 研究重点随着原生质体培养的发展一次次地发生了 转移 [7] 。早期原生质体培养(70 年代)主要在茄科植物 上获得成功，而后又广泛进行了十字花科和伞形科等 的体细胞杂交 [8] 。目前的体细胞杂交工作已多数集中 于经济植物上，所得到的体细胞杂种丰富了作物的基 因库，对直接应用或者进一步开展有性杂交育种工作 都提供了宝贵的材料。如今，一些研究工作者把细胞 融合技术运用在林木育种上。林木常规育种的特殊 性，即生长周期长、有性不亲和等现象使得林木原生 质体研究越来越受到人们的重视。体细胞杂交技术可 克服远缘杂交的不亲和性，创造新的育种材料，为林 木抗性育种带来一条新的途径。 诸葛强等 [9] 显微镜下观察融合全过程 [17] ，整个过程中的参数容易 控制。至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的融 合。影响电融合的效果主要是电压大小、持续的时间 和原生质体的尺寸 [18] 。电融合在保持原生质体的活 力，减少细胞膜的损害和原生质体的畸变、破裂及细 胞器的融合等方面都要好于化学融合 [19] 。 Schweiger [20] 把电融合法与微培养法相结合，建立了单对原生质体 融合技术程序，不仅改进了融合方法，而且是两亲本 间一对一融合，有可能解决融合细胞的选择问题，是 一种有前途的技术体系。目前正在研究用电脑控制进 植物细胞融合及应用概述 行自动化操作，以提高操作效率。 Li 等 [21] 建立的激光融合法在融合烟草原生质体 时避免了亲本原生质体中叶绿体分布的影响，是近年 来比较新的一种方法。利用激光微束可以对相邻细胞 的接触区细胞进行破坏，从而诱导许多细胞中所需的 两个相邻细胞融合。1987 和 1989 年德国海德堡理化 研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合，从开 始照射到完成融合仅需几秒钟 [22] [7] 。 近年来，兴起的不对称融合也是一种筛选杂种细 胞的方法。不对称融合指一方亲本的全部原生质与另 一方亲本的部分核物质及胞质物质重组，产生不对称 杂种 [7] 。 一般用碘乙酰胺(IOA)或碘乙酸(IA)处理受体， 使其细胞失活，单独培养不能生长和分裂；而供体由 于受到射线辐射，大部分染色体受到损伤，细胞不能 生长；只有融合体发生互补作用才能生长，从而挑出 杂种，用此法筛选已有很多成功的例子 [30,31] [7] 。 但是我们必须清醒地认识到，体细胞杂交中仍存 在一些函待解决的难题： 1) 原生质体再生困难直接阻 碍了体细胞杂交在作物育种上的应用； 2) 体细胞杂种 或胞质杂种本身染色体数目不定，染色体结构发生变 异，及异常的减数分裂等都会造成培养过程中表现不 稳定 [39] ；3) 用射线照射非对称杂交的供体亲本，从悬 浮培养细胞中提取原生质体，或通过芽再生途径获得 植株等都会加重杂种染色体的丢失 [40] ，而且染色体丢 失是一个非常复杂的过程，还受双亲的遗传关系、倍 性水平等因素影响 [41]…”