La conexina 43 como modulador de la captación de glucosa en astrocitos

Abstract

Tampón Tris Acetato-EDTA 1.2.3.4. Protección neuronal. 12 1.2.3.5. Apoyo en la migración neuronal. 12 1.2.3.6. Proliferación celular. 13 1.2.3.7. Tráfico de metabolitos y captación de glucosa. 13 1.2.4. Regulación de la permeabilidad de las uniones comunicantes en astrocitos. 14 1.2.4.1. Endotelina-1 14 1.2.4.2. Carbenoxolona 16 1.3. Comunicación intercelular y captación de glucosa. 17 1.3.1. Transporte de glucosa y mecanismos de regulación. 19 1.3.2. Fosforilación de la glucosa y mecanismos de regulación. 23 1.4 El oncogen c-Src. 25 1.5 Papel de Hif-1α como regulador de la captación de glucosa. 30 1.6 La gliosis reactiva. 34 2. PLAN DE TRABAJO 3 9 . M A T E R I A L Y M É T O D O S 4 3 . 1 . M A T E R IA L 4 3 3.1.1. Especie ensayada, condiciones del animalario. 43 3.1.2. Medios instrumenta l e s 4 3 3.1.3. Productos 45 3.1.3.1. Productos utilizados para la preparación de los cultivos celulares 45 3.1.3.2. Productos utilizados en los experimentos para la detección del mRNA 45 3.1.3.3 Productos utilizados en los experimentos para el análisis de proteínas 46 3.1.3.4. Productos empleados para el silenciamiento génico 48 3.1.3.5. Productos utilizados para los estudios de captación de glucosa. 49 3.1.3.6. Otros productos 49 3 . 2 . M É T O D O S 4 9 3.2.1. Preparación de los cultivos celulares 49 3.2.1.1. Composición de las disoluciones. 49 3.2.1.2. Preparación del cultivo primario de astrocitos 50 3.2.2. Tratamientos celulares en astrocitos 51 3.2.3. RT-PCR y q-PCR 52 I. Extracción del RNA total de los cultivos 52 II. Cuantificación del RNA 52 III. Retrotranscripción (RT) IV. Cuantificación del cDNA producto de la retrotranscripción. 53 V. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 53 VI. Análisis de datos 53 3.2.4. Silenciamiento del mRNA de proteínas específicas mediante la técnica del siRNA (small interfering RNA) .5 3 3.2.5. Determinación de la permeabilidad celular 55 3.2.6. Determinación de la expresión de proteínas mediante análisis de transferencia tipo Western 55 I Extracción de proteínas 56 II. Cuantificación de proteínas 56 III. Preparación de los geles 56 IV. Preparación de las muestras para la electroforesis 56 V. Electroforesis de proteínas 56 V I . E l e c t r o t r a n s f e r e n c i a 5 6 VII. Visualización de las proteínas y bloqueo de la membrana 57 VIII. Inmunodetección 57 3.2.7. Experimentos realizados "in vivo" en ratones C57BL6 y hGFAP-eGFP 58 3.2.7.1. Inyección de ácido kaínico en los ratones C57BL6 y hGFAP-eGFP, y preparación del tejido. 58 3.2.8. Inmunohistoquímica 58 3.2.9. Determinación de la captación de 2-desoxi-D-glucosa. 59 3.2.10 Análisis estadístico 60 4 . -R E S U L T A D O S 6 3 4.1 Estudio de la relación entre la conexina43 y la captación de glucosa de los astrocitos en la gliosis reactiva provocada por una lesión cerebral. 63 4.1.1 Estudio de la presencia de ET-1 tras la gliosis reactiva provocada por una lesión cerebral. 64 4.1.2 Estudio de la expresión de las proteínas implicadas en la captación de glucosa en astrocitos tras una lesión cerebral. 65 4.2 Efecto de la pérdida de l...