Kristalle in Minutenschnelle: Sofortige Mikrokristallisation verschiedenster Varianten der CYP102A1‐(P450BM3)‐Hämdomäne

Abstract

Die Kristallisation der Hämdomäne von CYP102A1 (P450BM3) kann nach Modifizierung eine Herausforderung sein. Dennoch sind solche Kristallstrukturen unentbehrlich für die wirksame strukturbezogene Entwicklung von P450BM3 als Biokatalysator. Es wurde gezeigt, dass das Abietanditerpenderivat N‐Abietoyl‐l‐tryptophan (AbiATrp) ein hervorragender Kristallisationsbeschleuniger ist. Die Nutzung von Kristallen der P450BM3‐Hämdomäne mit AbiATrp als Impfkristalle ermöglichte die rasche Mikrokristallisation bei der naszierende Kristalle innerhalb von Sekunden nach Impfung erschienen. Hierdurch wurde eine Auswahl an Kristallen der P450BM3‐Hämdomäne erhalten, die bisher nicht kristallisierbare Täuschmoleküle, diverse künstliche Metalloporphyrine, welche verschiedenartige Liganden binden, sowie zusätzlich stark getaggte Hämdomänevarianten enthalten (37 zusätzliche Aminosäuren). Manche der Strukturen könnten als Modellverbindungen verschiedener Stadien des katalytischen Zyklus von P450BM3 genutzt werden.

Systematic Evolution of Decoy Molecules for the Highly Efficient Hydroxylation of Benzene and Small Alkanes Catalyzed by Wild-Type Cytochrome P450BM3

“…To understand how some of the best novel decoy molecules prepared herein elicit their superior properties, we turned to X-ray protein crystallography and attempted to cocrystallize P450BM3 in the presence of some of the best decoy molecules determined in steps 4 and 6 (Figure b). Using crystals of P450BM3 in complex with N -abietoyl- l -tryptophan (AbiATrp) as seeds, we succeeded in the crystallization and structural investigation of P450BM3 in complex with 3CPPA-Pip-Phe (a molecule discovered in step 6) (Figure a,d), N -(3-cyclohexyl)­propanoyl- l -prolyl- l -phenylalanine (3CHPA-Pro-Phe, a molecule discovered in step 4, Figure b), and N -enanthoyl- l -prolyl- l -phenylalanine (C7AM-Pro-Phe, a molecule discovered in step 4, Figure c,e). Electron density clearly assignable to each decoy molecule was observed in the substrate-binding pocket of P450BM3.…”

“…Crystallization of P450BM3 was performed using a previously reported procedure . The buffer of purified P450BM3 was dialyzed by spin centrifugation–dialysis into 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 200 μ M of decoy molecule and 0.2% (v/v) DMSO.…”

“…To this mixture, 0.2 μL of seed solution and 40 μL of reservoir solution were added and incubated at 20 °C. Preprepared crystals of N -abietoyl- l -tryptophan (AbiATrp)-bound P450BM3 heme domain were used for seeding.…”

“…Data collection and refinement were performed using a previously reported procedure. , Crystals were flash-cooled in liquid nitrogen. X-ray diffraction data sets were collected on the beamline BL26B2 equipped with a MAR225 CCD detector at SPring-8 (Hyogo, Japan) with a 1.0 Å wavelength at 100 K (3CPPA-Pip-Phe and C7AM-Pro-Phe) or on the beamline BL2S1 equipped with a ADSC QUANTUM 315r CCD detector at the Aichi Synchrotron Radiation Center (Aichi, Japan) with a 1.0 Å wavelength at 100 K (3CHPA-Pro-Phe).…”

Ein Verbindung‐I‐Analogon deckt die vorübergehende aktive Spezies eines Zytochrom‐P450‐Enzymes auf: Einblick in die Stereoselektivität P450‐katalysierter Oxidationen

“…Eine denkbare Lösung zur Entwirrung dieses gordischen Knotens lässt sich aus einer kürzlich erschienen Veröffentlichung unserer Forschungsgruppe entnehmen, in der wir über die schnelle Kristallisation von P450BM3 in Gegenwart von N ‐Abietoyl‐ l ‐Tryptophan (AbiATrp) berichteten, [14] wodurch erstmals die einfache Satzkristallisation von P450BM3 im Komplexe mit verschiedenen künstlichen Hämderivaten, einschließlich Oxomolybdänmesoporphyrin IX (Mo(O)MPIX), mit hoher Auflösung ermöglicht wurde. In diesem Berichte haben wir auf die mögliche Anwendung von Mo(O)MPIX als Modell für die hochvalente Häm‐Oxoeisen(IV)‐Spezies Vbd I (Abbildung 1a) hingewiesen und zwar aufgrund 1) der engen strukturellen Ähnlichkeit zwischen Vbd‐I des Häms und Mo(O)MPIX und 2) der Stabilität und inhärenten Reaktionsträgheit der Sauerstoffspezies von Mo(O)MPIX gegenüber organischen Substraten.…”