Knockout Rats via Embryo Microinjection of Zinc-Finger Nucleases

Abstract

The toolbox of rat genetics currently lacks the ability to introduce site-directed, heritable mutations into the genome to create knockout animals. Using engineered zinc-finger nucleases (ZFNs) designed to target an integrated reporter and two endogenous rat genes, Immunoglobulin M (IgM) and Rab38, we demonstrate that a single injection of DNA or mRNA encoding ZFNs into the one-cell rat embryo leads to a high frequency of animals carrying 25-100% disruption at the target locus. These mutations are faithfully and efficiently transmitted through the germline. Our data demonstrate the feasibility of targeted gene disruption in multiple rat strains within four months time, paving the way to a humanized monoclonal antibody platform and additional human disease models.The laboratory rat is a well-established model for the genetic dissection of human diseaserelated traits (1) despite the fact that targeted modification of its genome is largely intractable. We investigated the application of engineered zinc-finger nucleases (ZFNs;(2)) for the elimination of specific rat gene function and generation of "knockout" rats. ZFNs induce sitespecific, double-strand DNA breaks that can be repaired by the error-prone non-homologous end joining DNA repair pathway to result in a targeted mutation (Fig. 1A). In the fruit fly and zebrafish, direct embryo injection of ZFN-encoding mRNA has been used to generate heritable knockout mutations at specific loci (2).The design and validation of ZFN reagents to target a single-copy Green Fluorescent Protein (GFP) transgene inserted in a rat chromosome and two endogenous rat genes, IgM and

Une nouvelle ère pour la génétique du rat

“…Elle repose sur l'utilisation Contre toute attente, l'expression de nucléases artificielles dans les cellules embryonnaires aux premiers stades de développement n'est pas toxique et semble avoir une activité de cassure de l'ADN limitée à la séquence choisie par l'expérimentateur. En effet, l'examen des régions du génome qui présentent une séquence proche de celle reconnue par les nucléases à doigts de zinc utilisées n'a révélé jusqu'à présent aucune mutation [6][7][8]. De toute façon, dans l'hypothèse où de telles modifications non désirées surviendraient, elles seraient dans la plupart des cas rapidement perdues au cours des croisements nécessaires à l'établissement des lignées mutantes.…”

“…Chez les mammifères, c'est le rat qui a ouvert la voie. En effet, il a été montré dans cette espèce que la simple micro-injection dans le zygote d'ARN codant pour des nucléases à doigts de zinc spécifiques permettait d'obtenir des mutations dans un gène ciblé à une fréquence très élevée [6]. Dans cette première étude, 17 % des ratons nés à la suite de cette manipulation étaient porteurs d'altérations génétiques au niveau de sites de coupures situés dans le gène IgM, le gène Rab38 ou un transgène préa-lablement intégré dans le génome par transgenèse classique.…”

“…Des mutations de type « perte de fonction » sont obtenues avec une efficacité tellement élevée que quelques séances de micro-injection suffisent pour obtenir des rats mutants. L'efficacité est telle que parfois les deux allèles du gène ciblé sont simultanément modifiés dans les animaux fondateurs [6,8]. Il faut néanmoins garder à l'esprit que des modifications peuvent encore survenir plusieurs jours après l'injection et se retrouver ainsi à l'état mosaïque chez les animaux fondateurs [7,8].…”

Neuroscience Research Using Non-human Primate Models and Genome Editing

“…Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas system are mainly used as engineered nucleases. A number of genetically modified animals have already been generated using such restriction enzymes (Bedell et al 2012;Geurts et al 2009;Hauschild et al 2011;Mashimo et al 2010;Ochiai et al 2010;Sung et al 2013;Suzuki et al 2013;Wang et al 2013;Yang et al 2013). Among these, the CRISPR/Cas system was developed the most recently and is particularly promising (Cong et al 2013;Mali et al 2013).…”

Germline Transmission of a Novel Rat Embryonic Stem Cell Line Derived from Transgenic Rats

“…The establishment of germline-competent rat embryonic stem (ES) cell lines enables ES-cell-based gene targeting in rats [6][7][8][9][10]. Zinc-finger nuclease and transcription activator-like effector nuclease-mediated gene targeting enables generation of knockout rats through pronuclear injection [11,12]. As a result, the ability to generate mutant rats is rapidly increasing.…”