Kinetic studies of recombinant rabies virus glycoprotein (RVGP) cDNA transcription and mRNA translation in Drosophila melanogaster S2 cell populations

Abstract

Recombinant rabies virus glycoprotein (RVGP) was expressed in cell membranes of stably transfected Drosophila S2 cells using constitutive and inducible promoters. Although with quantitative differences of RVGP expression in both systems, the cDNA transcription, as evaluated by relative RVGP mRNA levels measured by qRT-PCR, sustained the amount of RVGP producing cells and the RVGP volumetric (P RVGP ) productivity. At the transition to the stationary cell growth phase, once the cell culture slowed down its rate of multiplication, an accumulation of RVGP mRNA and RVGP was clearly observed in both cell populations. Nevertheless, cell cultures performed under sub-optimal temperatures indicated that an envisaged increase in the RVGP production is not only dependent on cell growth rate, but essentially on optimal cell metabolic state.

Impact of recombinant Drosophila S2 cell population enrichment on expression of rabies virus glycoprotein

“…It is known that cell translation and post-translation machinery have limited processing capacity (Palomares et al 2004), and partially matured forms of proteins can be degraded by proteasome activity. It has previously been reported that an increase of RVGP expression in S2 recombinant cells occurred just after a drop in RVGP mRNA levels (Astray et al 2013). Here we show that high production of RVGP mRNA does not necessarily result in high protein production.…”

“…The RT-qPCR was performed according to published guidelines (Nolan et al 2006). The reaction standardization was previously published (Astray et al 2013). Briefly, by evaluating the absence of dimers, lowest Ct, highest end point fluorescence, and absence of signal in the negative controls, the primer concentration was determined as 200 nM for both targets and the best cDNA concentration as 7.2 ng/mL (the same amount was also used for RVGP cDNA amplification).…”

Desenvolvimento de um método de imunofluorescência aplicado à detecção de anticorpos contra o arbovírus <i>Mayaro</i>.

“…Dessa forma, os tempos em que as quantidades de RNA relativo são menores coincidem com os tempos em que a glicoproteína E2 foi detectada de maneira mais evidente por imunofluorescência. A quantificação relativa de mRNA a partir de 72 horas permitiu verificar um perfil de expressão do mRNA da proteína E2, semelhante ao encontrado em trabalhos prévios realizados para a análise da expressão do mRNA da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células S2, em que há uma queda na abundância do transcrito justamente no momento em que se inicia o intervalo de maior expressão recombinante(ASTRAY et al, 2013;SANTOS et al, 2016). Os dados para a subpopulação S2MtBipMAYV(E3E2)_SC não foram apresentados pois não houve rendimento de RNA total durante a extração por kit.6 DISCUSSÃOA ocorrência das doenças febris agudas causadas por arbovírus como Zika, Dengue, Chikungunya tem sido hoje um alerta para a possibilidade de novos surtos de Febre Amarela e para a transmissão urbana de outra arbovirose, muito similar à causada por CHIKV, a chamada Febre Mayaro, pois todos esses apresentam vetores em comum.…”

“…Isso pode ser resultado de algum nível de citotoxicidade da E2 expressa em sua sequência original, dado que o início do declínio da viabilidade celular coincide com os tempos em que é observado seu acúmulo nas células (tempos após 120 horas de indução), como avaliado por IFI.Para compreender melhor a expressão da glicoproteína E2 pelas linhagens celulares, realizamos um estudo cinético da quantidade do mRNA específico da E2 após a indução. Esse estudo se baseou em procedimentos anteriormente realizados para o estudo da cinética de expressão da glicoproteína da raiva em células S2(ASTRAY et al, 2013;SANTOS et al, 2016). Foi observado que, de maneira geral, o mRNA de E2 apresentou níveis menores em tempos superiores a 120 h após a indução.…”

“…Foi observado que, de maneira geral, o mRNA de E2 apresentou níveis menores em tempos superiores a 120 h após a indução. Com base nos estudos anteriores citados(ASTRAY et al, 2013;SANTOS et al, 2016), esses resultados apontam uma maior atividade de tradução neste período e, por isso, maior expressão na membrana e menor quantidade do RNA mensageiro da E2. De fato, a mesma relação foi encontrada para a expressão da RVGP em células S2 (ASTRAY et al, 2013), de forma que a quantidade de mRNA relativo à RVGP diminuiu quando a quantidade da proteína aumentou, exatamente como ocorreu com as subpopulações de S2 expressando E2.…”