Kinetic and structural analysis of the Mg(2+)-binding site of the guanine nucleotide-binding protein p21H-ras.

John, Jacob; Rensland, Hans; Schlichting, Ilme; Vetter, Ingrid R.; Borasio, Gian Domenico; Goody, Roger S.; Wittinghofer, Alfred

doi:10.1016/s0021-9258(18)54022-9

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“…The H-rasla-35 mutant did not exhibit any interfering functions, which is consistent with observations by others that Thr-35 substitutions of H-ras block its own function without interfering with endogenous H-ras functions (14,28). We also tested if membrane localization is required for the dominant interfering properties of H-rasTyr 7.…”

Section: Methodssupporting

confidence: 88%

“…Those interfering mutants that conferred a phenotype similar to a rasi disruption were altered at amino acid position 62, where an aspartic acid encoded by GAC was changed to a glycine (GGC, transition, SPras161y-62) or to a tyrosine (TAC, transversion, SPraslTYr-62). Others have previously introduced mutations into the analogous Asp-57 of H-ras, but interfering mutants were not created thereby (14,28).…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

“…We have shown here that whereas wild-type H-ras binds GDP and GTP with similar affinities, a type II interfering mutant binds guanine nucleotides, but with a preference for GDP over GTP. This is a property shared by type I interfering mutants (14,15,28). Such a bias, however, is insufficient for predicting whether a RAS mutant will be interfering, since an Ala-57 mutation (28) was not interfering although it exhibited a 39-fold bias for GDP over GTP.…”

Section: H-rasmentioning

confidence: 99%

“…This is a property shared by type I interfering mutants (14,15,28). Such a bias, however, is insufficient for predicting whether a RAS mutant will be interfering, since an Ala-57 mutation (28) was not interfering although it exhibited a 39-fold bias for GDP over GTP. A defect in nucleotide binding to RAS proteins also cannot account for dominant interference properties, since activated mutants of H-ras that exhibit profound defects in nucleotide binding have been described (16,30).…”

Section: H-rasmentioning

confidence: 99%

“…Furthermore, in a two-hybrid assay, yeast CDC25 was found to bind the RAS2Ala-22 mutant more strongly than wild-type RAS2 (38). The mechanism by which dominant interfering mutants titrate out GEFs remains unclear, but there is evidence to suggest that the interfering mutants are locked into an inactive conformation that binds to and sequesters the intracellular pool of GEFs (14,28,38).…”

mentioning

confidence: 99%

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Two Types of RAS Mutants That Dominantly Interfere with Activators of RAS

Jung

Wang

Ballester

et al. 1994

Molecular and Cellular Biology

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In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, ras1 regulates both sexual development (conjugation and sporulation) and cellular morphology. Two types of dominant interfering mutants were isolated in a genetic screen for ras1 mutants that blocked sexual development. The first type of mutation, at Ser-22, analogous to the H-rasAsn-17 mutant (L. A. Feig and G. M. Cooper, Mol. Cell. Biol. 8:3235-3243, 1988), blocked only conjugation, whereas a second type of mutation, at Asp-62, interfered with conjugation, sporulation, and cellular morphology. Analogous mutations at position 64 of Saccharomyces cerevisiae RAS2 or position 57 of human H-ras also resulted in dominant interfering mutants that interfered specifically and more profoundly than mutants of the first type with RAS-associated pathways in both S. pombe or S. cerevisiae. Genetic evidence indicating that both types of interfering mutants function upstream of RAS is provided. Biochemical evidence showing that the mutants are altered in their interaction with the CDC25 class of exchange factors is presented. We show that both H-rasAsn-17 and H-rasTyr-57, compared with wild-type H-ras, are defective in their guanine nucleotide-dependent release from human cdc25 and that this defect is more severe for the H-rasTyr-57 mutant. Such a defect would allow the interfering mutants to remain bound to, thereby sequestering RAS exchange factors. The more severe interference phenotype of this novel interfering mutant suggests that it functions by titrating out other positive regulators of RAS besides those encoded by ste6 and CDC25.

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Section: Methodssupporting

confidence: 88%

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Section: H-rasmentioning

confidence: 99%

Section: H-rasmentioning

confidence: 99%

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Two Types of RAS Mutants That Dominantly Interfere with Activators of RAS

Jung

Wang

Ballester

et al. 1994

Molecular and Cellular Biology

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GEF-mediated GDP/GTP exchange by monomeric GTPases: A regulatory role for Mg2+?

Pan

Wessling‐Resnick

1998

Bioessays

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Ras – ein molekularer Schalter bei der Tumorentstehung

Wittinghofer

Waldmann

2000

Angewandte Chemie

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Das Protein Ras ist namensgebend für eine Superfamilie von Proteinen, den so genannten Ras-ähnlichen GTP-bindenden Proteinen. Ihre gemeinsamen Eigenschaften sind ein Molekulargewicht von 20 ± 25 kDa und die Fähigkeit, Guaninnucleotide zu binden. Sie fungieren als molekulare Schalter, indem sie zwischen einer GTP-gebundenen aktiven und einer GDP-gebundenen inaktiven Konformation wechseln. Sie regulieren eine Vielzahl von zellulären Reaktionen, können aber dennoch in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: zum einen die Signalproteine, die katalytisch wirken und eine wichtige Rolle bei der Kommunikation zwischen Zellen und Zellkompartimenten spielen, und zum anderen die stöchiometrisch wirksamen Transportfaktoren, die den Materialfluss zwischen Zellkompartimenten regulieren.In diesem Übersichtsartikel werden wir uns auf das Signalprotein Ras konzentrieren, das einer der Hauptschalter vieler Signaltransduktionsprozesse ist, welche z. B. Wachstum, Differenzierung, Zellcyclus und Apoptose regulieren, die einander zum Teil entgegengesetzte Prozesse darstellen. Auch wenn wir die biologische Funktion von Ras umreiûen werden, so konzentrieren wir uns in diesem Artikel auf strukturbiochemische und biophysikalische Aspekte des Proteins und der Anwendung dieses Wissens bei der Entwicklung potentieller Antitumorwirkstoffe.Für detailliertere Informationen über die Biologie von Ras und ältere Literaturangaben sollten andere Übersichtsartikel zu Rate gezogen werden. [1±5] [*] Prof.A. Wittinghofer und H. Waldmann Schema 1. Der Ras-Cyclus. In der GDP-gebundenen Form ist Ras inaktiv. Es kann durch die Wirkung von Guaninnucleotid-Austauschfaktoren (GEFs) aktiviert werden. In der GTP-gebundenen Form wechselwirkt es mit Effektoren, Proteinen, die über ihre Fähigkeit definiert sind, die GTP-Form zu erkennen. Um den Cyclus zu schlieûen, hydrolysiert Ras GTP zu GDP und anorganischem Phosphat (P i ). Im Prinzip kann Ras auch aktiviert werden, indem die GTPase-Reaktion inhibiert wird.Beladung mit GTP, der in der lebenden Zelle vorherrschenden Guaninnucleotidform, erleichtert. Im GTP-gebundenen Zustand wechselwirkt Ras mit Effektoren. Als solche definiert man Moleküle, die spezifisch mit der GTP-Form wechselwirken und ein Signal weiterleiten. Die Signalweiterleitung wird durch die an sich langsame, durch Ras-spezifische GAPs aber beschleunigte GTPase-Aktivität von Ras gestoppt. Im GDP-gebundenen Zustand kann Ras nicht mehr mit Effektoren wechselwirken.Die Lebensdauer eines von Ras weitergeleiteten Signals wird durch die Lebenszeit der aktiven Form bestimmt. Wird diese künstlich verlängert, so kann die nun unregulierte biologische Antwort zu dramatischen Konsequenzen in der Zelle führen. Ras wurde als das zentrale Gen in Tumorviren von Nagern entdeckt (der Name Ras leitet sich von Rat sarcoma ab) und daher als Onkogen deklariert, d. h. als Gen, das in der Lage ist, Tumore in Tieren oder Zellkulturen zu induzieren. [2,5] Später wurden aktivierte Formen von Ras auch in menschlichen Tumoren gefunden. Es wird heute angenommen, dass bis zu 30 %...

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Kinetic and structural analysis of the Mg(2+)-binding site of the guanine nucleotide-binding protein p21H-ras.

Cited by 243 publications

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