Isolation and characterization of Dehydrin promoter region from sugarcane (Saccharum officinarum L.)

Abstract

The development of molecular biology techniques nowadays has enabled to engineer drought tolerant sugarcane by genetic engineering to accelerate the breeding program. Dehydrin (DHN) is known to have an important role in plant response and adaptation to abiotic stresses (drought, high salinity, cold, heat, etc.). While plant tissues are subjected to drought stress (dehydration), DHN protein is accumulated to high content throughout all vegetative or generative tissues. The research aimed to isolate and characterize the DHN promoter from sugarcane that can be used as transformation material in generating drought tolerant sugarcane. Specific primers for DHN promoter amplification were designed and DHN promoter region was successfully isolated by PCR cloning method. Two putative promoter sequences were identified namely Pr-1DHNSo and Pr-2DHNSo. In silicoanalyses were carried out and cis-regulatory elements motifs that play a role in adaptation on abiotic stress as well as biotic stress including ABRE, MBS, CGTCA-motif, TGACG-motif, GARE-motif, P-box TCA-element and Box-W1 were identified. The promoter Pr-1DHNSo was then cloned into pBI121 expression vector by Overlap Extention PCR (OE-PCR) for further characterization. Functional test of the promoter construct pBI- Pr-1DHNSo was conducted through Agrobacterium transformation into sugarcane calli. GUS assay and PCR analysis showed that the DHN promoter was transformed and expressed in the sugarcane calli.

Analisis ko-ekspresi gen-gen regulasi upstream dari gen Dehydrin di tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) pada kondisi cekaman kekeringan

“…dilaporkan telah berhasil diisolasi (PrDHN-5) dan terbukti merupakan promoter yang sangat terinduksi oleh cekaman abiotik (Amar et al, 2013). Promoter DHN yang merupakan fragmen genomik dari gen DHN (Pr-1DHNSo) telah diisolasi dan dikonstruksikan dengan gen βglucoronidase (GUS) ke dalam vektor ekspresi (Minarsih et al, 2020). Gen GUS merupakan indikator atau reporter gene untuk menentukan regulasi dari promoter DHN di dalam konstruk yang telah dibuat.…”

“…Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa promoter gen DHN yang telah diisolasi dari tebu varietas PSJT 941 memiliki beberapa cis regulating element yang diantaranya adalah gengen faktor transkripsi yaitu NAC, MYB, dan DREB (Minarsih et al, 2020). Faktor transkripsi tersebut diketahui ikut berperan dalam respons terhadap cekaman kekeringan (Mizoi et al, 2012;Nakashima et al, 2012;Li et al, 2015).…”

“…Bahan tanam yang digunakan untuk analisis awal ekspresi gen-gen faktor transkripsi adalah daun tebu varietas PSJT 941 yang diberi perlakuan cekaman kekeringan selama 0 dan 16 hari dari hasil penelitian Minarsih et al (2018). Sedangkan bahan tanam yang digunakan untuk analisis ekspresi gen-gen SoNAC, SoDREB, dan GUS adalah tanaman tebu transgenik varietas Kidang Kencana yang membawa konstruk promoter DHN dari hasil penelitian sebelumnya (Minarsih et al, 2020). Induksi dan pembesaran tunas dari kalus tebu transgenik dilakukan di media MS2 yang mengandung IAA (2 mg L -1 ) dan BAP (0,2 mg L -1 ), selama 2-3 bulan.…”

“…Analisis ko-ekspresi gen-gen upstream regulator dari gen SoDHN Gen-gen SoMYB, SoNAC, dan SoWRKY berada pada tingkat regulasi di atas SoDHN. Pada penelitian sebelumnya, elemen pengatur cis telah diidentifikasi pada daerah promoter gen SoDHN yang menunjukkan potensi regulasi ekspresi SoDHN oleh gen-gen SoMYB, SoNAC, dan SoWKRY (Minarsih et al, 2020). Pasangan primer untuk analisis ekspresi gen telah didesain dan sekuen-sekuennya ditampilkan pada Tabel 1.…”

“…SoNAC dipilih berdasarkan hasil percobaan sebelumnya dimana ekspresinya meningkat lebih tinggi dibandingkan faktor transkripsi lainnya yaitu SoMYB dan SoWRKY. Gen SoNAC dan SoDREB juga merupakan gen regulator yang mempengaruhi ekspresi gen SoDHN dan diujikan menggunakan gen GUS sebagai gen reporter yang telah dikonstruksi dengan Pr-1DHNSo (Minarsih et al, 2020). Hasil yang diperoleh digunakan untuk mengetahui pola ekspresi gen SoNAC, SoDREB, dan GUS yang telah dikonstruk dengan Pr-1DHNSo akibat cekaman kekeringan.…”