Involvement of Phenylalanine 297 in the Construction of the Substrate Pocket of Human Aminopeptidase B

Abstract

Aminopeptidase B (APB, EC 3.4.11.6) preferentially hydrolyzes the N-terminal basic amino acids of synthetic and peptide substrates and requires a physiological concentration of NaCl for optimal activity. In this study, we used site-directed mutagenesis and molecular modeling to search for an amino acid residue that is critical for the enzymatic properties of human APB. Substitution of Phe297 with Tyr caused a significant decrease in hydrolytic activity toward synthetic and peptide substrates as well as chloride anion sensitivity. Molecular modeling suggests that Phe297 contributes to the construction of the substrate pocket of APB, which is wide enough to hold a chloride anion and allow the interaction of Gln169 with the N-terminal Arg residue of the substrate through bridging with the chloride anion. These results indicate that Phe297 is crucial for the optimal enzymatic activity and chloride anion sensitivity of APB via formation of the optimal structure of the catalytic pocket.

Intranasal Coadministration of a Diazepam Prodrug with a Converting Enzyme Results in Rapid Absorption of Diazepam in Rats

“…S-avizafone dihydrochloride (AVF•2HCl) was synthesized with .99% purity, 99% enantiomeric excess from 5-chloro-2-methylaminobenzophenone according to the procedure described previously (Kapoor et al, 2016). Recombinant human Coadministration of Prodrug and Converting Enzyme to Rats aminopeptidase B (APB) enzyme was produced by inserting the aminopeptidase B gene (RNPEP) DNA sequence encoding for APB and a His tag into a pQE-30 Xa vector, transforming the JM109 strain of Escherichia coli with the resultant plasmid, inducing APB expression with IPTG, and purifying the expressed APB by affinity capture chromatography (Ogawa et al, 2014;Ohnishi et al, 2015). Purity of APB was .80% by gel electrophoresis.…”

Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 beyond Antigenic Peptide-Processing Enzyme in the Endoplasmic Reticulum

“…They are known to play roles in protein maturation, activation, modulation, and degradation of bioactive peptides, as well as determining protein stability. 1) Among them is endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) belonging to M1 family of aminopeptidases, which require Zn 2+ for hydrolysis (gluzincin). Phylogenetic tree in Fig.…”

Efeito de drogas sintéticas inibidoras do fator de necrose tumoral alfa na artrite reumatoide em ratos

“…Na inflamação, é a principal indutora da síntese de proteínas de fase aguda e estimula a produção de anticorpos por linfócitos B (YAO et al, 2014;SCHELLER et al, 2011;FONSECA et al, 2009). A reação de fase aguda é uma das primeiras respostas à lesão e manifesta-se por alterações nos níveis de algumas proteínas no soro, produzidas pelo fígado, como o aumento de proteína Creativa (PCR), fibrinogênio, ferritina e soro amiloide A e a diminuição de transferrina e albumina (ASSIER et al, 2010;FONSECA et al, 2009 (CADEL et al, 2015;OHNISHI et al, 2015;CADEL et al, 2013;PHAM et al, 2007). Em animais artríticos do modelo CIA, a atividade APB encontra-se diminuída na fração solúvel de PBMCs e aumentada nas frações solúvel e de membrana do tecido sinovial, sugerindo que essa atividade poderia ser uma potencial marcadora do desenvolvimento de AR (MENDES, 2012;MENDES et al, 2011).…”

“…Neutrófilos também se apresentam, causando dano tecidual por meio da secreção de produtos como enzimas proteolíticas, oxigênio e nitrogênio derivados de radicais livres (BOMBINI et al, 2004;HARRIS, 1990 A APB, além de hidrolisar resíduos básicos (arginina e lisina) na cadeia peptídica (HUI e HUI, 2006;PIESSE et al, 2004;FOULON et al, 1999), é estruturalmente semelhante à enzima LT-A4-H (33% de identidade e 48% de similaridade), também exibindo essa atividade (PHAM et al, 2007;PENNING et al, 2002;FOULON et al, 1999;CADEL et al, 1997). Por sua vez, a atividade peptidásica da APB ocorre sobre substratos com reconhecidas ações na regulação do processo angiogênico (HEFFELFINGER, 2007;RUIZ-ORTEGA et al, 2007;BALOGH et al, 1998), além de participar da maturação de hormônios peptídicos e neurotransmissores (CADEL et al, 2015;OHNISHI et al, 2015;CADEL et al, 2013) Além disso, é possível hipotetizar que esse efeito local de inibição da APB resulte na diminuição da angiogênese, quimiotaxia e estímulo de neutrófilos, sendo benéfica no tratamento da AR.…”