Intein-mediated affinity-fusion purification of the Escherichia coli RecA protein

Singleton, Scott F.; Simonette, Rebecca A.; Sharma, Neil C; Roca, Alberto I.

doi:10.1016/s1046-5928(02)00571-5

Cited by 28 publications

(35 citation statements)

References 49 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…In future studies, RecA could be purified from other species (42). Other extremophiles of interest in clude Serratia marcescens, which grows at −20°C, or Photobacterium profundum, which lives at 70 MPa.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Effects of pressure and temperature on the binding of RecA protein to single-stranded DNA

Merrin

Kumar

Libchaber

2011

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

View full text Add to dashboard Cite

The binding and polymerization of RecA protein to DNA is required for recombination, which is an essential function of life. We study the pressure and temperature dependence of RecA binding to single-stranded DNA in the presence of adenosine 5'-[γ-thio]triphosphate (ATP[γ-S]), in a temperature regulated high pressure cell using fluorescence anisotropy. Measurements were possible at temperatures between 5-60°C and pressures up to 300 MPa. Experiments were performed on Escherichia coli RecA and RecA from a thermophilic bacteria, Thermus thermophilus. For E. coli RecA at a given temperature, binding is a monotonically decreasing and reversible function of pressure. At atmospheric pressure, E. coli RecA binding decreases monotonically up to 42°C, where a sharp transition to the unbound state indicates irreversible heat inactivation. T. thermophilus showed no such transition within the temperature range of our apparatus. Furthermore, we find that binding occurs for a wider range of pressure and temperature for T. thermophilus compared to E. coli RecA, suggesting a correlation between thermophilicity and barophilicity. We use a two-state model of RecA binding/unbinding to extract the associated thermodynamic parameters. For E. coli, we find that the binding/ unbinding phase boundary is hyperbolic. Our results of the binding of RecA from E. coli and T. thermophilus show adaptation to pressure and temperature at the single protein level.pressure-temperature phase diagram | DNA binding protein | protein stability | protein functionality

show abstract

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Effects of pressure and temperature on the binding of RecA protein to single-stranded DNA

Merrin

Kumar

Libchaber

2011

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…The ␤ clamp was also purified using the method published for UmuD and UmuDЈ. DinB and RecA proteins were purified as described (31,33).…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

The Dimeric SOS Mutagenesis Protein UmuD Is Active as a Monomer

Ollivierre¹,

Sikora²,

Beuning

2011

Journal of Biological Chemistry

View full text Add to dashboard Cite

The homodimeric umuD gene products play key roles in regulating the cellular response to DNA damage in Escherichia coli. UmuD 2 is composed of 139-amino acid subunits and is up-regulated as part of the SOS response. Subsequently, damage-induced RecA⅐ssDNA nucleoprotein filaments mediate the slow self-cleavage of the N-terminal 24-amino acid arms yielding UmuD 2 . UmuD 2 and UmuD 2 make a number of distinct protein-protein contacts that both prevent and facilitate mutagenic translesion synthesis. Wild-type UmuD 2 and UmuD 2 form exceptionally tight dimers in solution; however, we show that the single amino acid change N41D generates stable, active UmuD and UmuD monomers that functionally mimic the dimeric wild-type proteins. The UmuD N41D monomer is proficient for cleavage and interacts physically with DNA polymerase IV (DinB) and the ␤ clamp. Furthermore, the N41D variants facilitate UV-induced mutagenesis and promote overall cell viability. Taken together, these observations show that a monomeric form of UmuD retains substantial function in vivo and in vitro.

show abstract

“…Beberapa peneliti telah berhasil melakukan pemurnian protein rekombinan menggunakan sistem IMPACT, namun kondisi inkubasi pemotongan optimum yang didapatkan oleh para peneliti sebelumnya seringkali berbeda. Guo et al (2004) berhasil memurnikan protein gelonin (29 kDa) menggunakan sistem IMPACT melalui induksi pemotongan pada suhu 25°C, pH 6,5 selama 48 jam, sedangkan Singleton et al (2002) telah berhasil memurnikan protein RecA (37 kDa) dengan kondisi inkubasi pemotongan pada suhu 37°C, pH 6,0 selama 16 jam. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan kondisi inkubasi pemotongan yang dibutuhkan dalam pemurnian pretrombin-2 pH menggunakan sistem IMPACT.…”

Section: Pendahuluanunclassified

“…Kondisi induksi pemotongan pada pH 7 mendekati nilai pK R histidin, yaitu 6,0 (Nelson & Cox 2013). Ada pula peneliti yang mendapatkan pH 6,0 dan 6,5 sebagai pH optimum dalam melakukan pemurnian protein rekombinan yang memanfaatkan aktivitas pemotongan C-terminal intein (Guo et al 2004;Singleton et al 2002). Perbedaan ini dapat terjadi akibat pengaruh residu asam amino protein target yang berada dekat dengan daerah katalitik Cterminal intein.…”

Section: Pemurnian Pretrombin-2 Ph Menggunakan Kolom Kitinunclassified

“…Oleh sebab itu, pada penelitian ini dilakukan kondisi pemurnian pada suhu 37°C, selama 16 jam dengan pH pemotongan 7,0. Suhu 37°C telah berhasil digunakan oleh Singleton et al (2002) Gambar 6 menunjukkan bahwa hasil pemurnian dengan kondisi induksi pemotongan pada suhu 37°C, 16 jam dengan pH pemotongan 7,0 tidak berhasil memotong pretrombin-2 dari C-terminal intein, baik pada resin maupun fraksi hasil elusi. Hal ini mungkin terjadi karena pada suhu tinggi terjadi perubahan konformasi protein fusi CBD-intein-PT2 pH , akibatnya, intein tidak berada pada konformasi yang benar, sehingga tidak menjalankan aktivitas pemotongan.…”

Section: Pemurnian Pretrombin-2 Ph Menggunakan Kolom Kitinunclassified

See 1 more Smart Citation

Pemurnian Pretrombin-2pH Hasil Ko-Ekspresi Chaperone pada Escherichia coli ER2566 Menggunakan Sistem IMPACT

et al. 2017

View full text Add to dashboard Cite

Abstrak: Pemurnian pretrombin-2 merupakan tahap penting dalam produksi trombin sebagai salah satu komponen lem fibrin untuk mengganti teknik jahitan pasca bedah mata. Pemurnian pretrombin-2 melalui sistem IMPACT memanfaatkan aktivitas pemotongan intein yang membawa penanda afinitas chitin-binding domain dan tidak memerlukan enzim protease tambahan. Pemotongan pretrombin-2 pH dari CBD-intein dapat dilakukan melalui C-terminal intein dengan induksi perubahan pH dan suhu tanpa memerlukan reagen kimia tambahan. Namun dibutuhkan kondisi pH, suhu dan waktu inkubasi yang sesuai untuk memotong pretrombin-2 pH dari Cterminal intein. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi pH, suhu dan waktu inkubasi pemotongan yang dibutuhkan dalam pemurnian pretrombin-2 pH dengan memanfaatkan aktivitas pemotongan C-terminal intein. Metode yang dilakukan adalah ekspresi gen CBD-intein-pt2 pH menggunakan vektor pTWIN1 dalam E. coli ER2566 disertai dengan ko-ekspresi chaperone menggunakan plasmid pG-KJE8, isolasi CBD-intein-PT2 pH dengan metode sonikasi, pemurnian pretrombin-2 pH menggunakan sistem IMPACT, serta karakterisasi pretrombin-2 pH hasil pemurnian dengan metode SDS-PAGE. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kondisi inkubasi pemotongan yang dibutuhkan untuk mendapatkan pretrombin-2 pH murni adalah pada suhu 25 o C, selama 48 jam dengan perubahan pH lingkungan kolom dari 8,5 ke 7,0. Namun efisiensi pemotongan yang dihasilkan sangat kecil. Hal ini mungkin disebabkan oleh kondisi suhu dan waktu inkubasi yang belum optimum serta diduga masih terdapat reaksi proteolisis yang mendegradasi pretrombin-2 pH murni yang dihasilkan. Keywords: Prethrombin-2, IMPACT, C-terminal cleavage of intein PENDAHULUANDalam penelitian ini dilakukan pemurnian protein rekombinan pretrombin-2 manusia yang merupakan prekursor dari trombin sebagai salah satu komponen penyusun lem fibrin. Ekspresi pretrombin-2 dilakukan dalam E. coli, karena kemampuannya untuk tumbuh dengan cepat, densitasnya tinggi pada media pertumbuhan yang murah serta memiliki ketersediaan vektor kloning dan galur inang mutan yang tinggi (Baneyx 1999).Singh & Panda (2005) menyatakan bahwa ekspresi level tinggi protein rekombinan di dalam E. coli sering kali menghasilkan agregat tak larut yang disebut dengan badan inklusi. Badan inklusi merupakan protein yang tidak memiliki aktivitas biologis (Vallejo & Rinas, 2005). Ada beberapa cara

show abstract

Intein-mediated affinity-fusion purification of the Escherichia coli RecA protein

Cited by 28 publications

References 49 publications

Effects of pressure and temperature on the binding of RecA protein to single-stranded DNA

Effects of pressure and temperature on the binding of RecA protein to single-stranded DNA

The Dimeric SOS Mutagenesis Protein UmuD Is Active as a Monomer

Pemurnian Pretrombin-2pH Hasil Ko-Ekspresi Chaperone pada Escherichia coli ER2566 Menggunakan Sistem IMPACT

Contact Info

Product

Resources

About