Inhibitor Screening Using Immobilized Enzyme Reactor Chromatography/Mass Spectrometry

Abstract

We describe the coupling of capillary-scale monolithic enzyme reactor columns directly to a tandem mass spectrometer for screening of enzyme inhibitors. A two-channel nanoLC system is used to continuously infuse substrate or substrate/inhibitor mixtures through the column, allowing continuous variation of inhibitor concentration by simply altering the ratio of flow from the two pumps. In the absence of inhibitor, infusion of substrate leads to formation of product, and both substrate and product ions can be simultaneously monitored in a quantitative manner by MS/MS. The presence of inhibitor leads to a decrease in product and an increase in substrate concentration in the column eluent. Knowing the product/substrate ratio and the total analyte concentration (P + S), the concentration of product eluting, and hence the relative enzyme activity, can be determined. Both IC50 and KI values can then be obtained by direct MS detection of the effect of inhibitors on relative activity. Inhibitor screening is demonstrated using reusable, sol-gel derived, monolithic capillary columns containing adenosine deaminase, directly interfaced to ESI-MS/MS. On-column enzyme activity was assessed by monitoring inosine and adenosine elution. It is shown that the method can be used for automated screening of the effects of compound mixtures on ADA activity and to determine the KI value of the known inhibitor, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, even when the compound is present within a mixture.

Imobilização de enzimas em suportes cromatográficos: uma ferramenta na busca por substâncias bioativas

“…47 Inicialmente, a cromatografia de afinidade foi utilizada quase que exclusivamente para isolamento e purificação de micro ou macromoléculas em misturas biológicas complexas, 61 mas, nos últimos tempos, tem se revelado como uma poderosa ferramenta para monitorar as interações ligante-proteína, substrato-proteína, inibidor-proteína e ligante-receptor 10,13 demonstrando grandes vantagens como uma das técnicas de high throughput screening (HTS). 21,62,63 A cromatografia de afinidade envolve, essencialmente, três passos: a imobilização de um alvo; a avaliação das modificações sofridas pela biomolécula, após a imobilização e, a determinação dos parâmetros de ligação do ligante, depois da inserção da proteína imobilizada no sistema de separação. 13 Um fator importante que pode ser usado na distinção entre mé-todos de afinidade de baixa e de alta eficiência é o material usado tabela 2.…”

“…84 Utilizando-se espectrometria de massas tandem com ionização por electrospray (ESI-MS/MS) é possível determinar a identidade dos compostos mais retidos na coluna enzimática, mesmo que presentes em misturas complexas. 21 Um exemplo muito interessante envolve a enzima acetilcolinesterase (AChE). A enzima AChE está envolvida na hidrólise do neurotransmissor ativo acetilcolina aos compostos colina e ácido acético.…”

“…A eficácia do método para o estudo de inibição foi comprovada utilizando inibidores conhecidos da AChE e os biorreatores foram aplicados aos estudos de determinação da capacidade inibitória IC 50 (concentração do inibidor capaz de reduzir pela metade a banda do produto obtida em condições de saturação) dos inibidores selecionados e na determinação do mecanismo de ação e das constantes de inibição. 32 Vários trabalhos estão descritos na literatura sobre a inibição e a determinação de constantes cinéticas de diferentes biorreatores 21,23,30,32,33,76,86,87 A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), por exemplo, é uma oxidase cofator-dependente (NAD + ) responsável pela oxidação fosforilativa do D-gliceraldeído-3-fosfato (D-G3P), produzindo 1,3-difosfoglicerato (1,3-DPGA), na presença de NAD + com formação de NADH e está envolvida na etapa vital do parasita Trypanosoma cruzi, o que a torna um alvo interessante na busca por novos ligantes. As condições para a imobilização, tanto da GAPDH humana quanto a do Trypanosoma cruzi, em capilares de sílica fundida, foram recentemente desenvolvidas, com sucesso, assim como as condições cromatográficas para mensurar o NADH formado na reação enzimática através de cromatografia mutidimensional.…”

“…Na presença de inibidores essa razão sofre alteração em favor do substrato. 21 No entanto, em ambos os casos a presença simultânea do substrato e do inibidor na fase móvel pode causar interferências através da forte absorção na detecção por UV e supressão do íon no MS.…”

“…2,19 A segunda, engloba os biorreatores desenvolvidos para triagem de substratos e para os estudos das características cinéticas das enzimas. 20 Nessa segunda classe, os IMER têm sido amplamente utilizados para separação e identificação de metabólitos, 21 nos estudos de metabolismo dos fármacos, 22,23 para análise e síntese enantiosseletiva, 2,24-26 na digestão proteolítica de proteínas on-line, 27 no controle biotecnoló-gico de fármacos, 28 e para a identificação de substratos e/ou inibidores, na busca por novos ligantes. [29][30][31][32][33][34][35] Também merece destaque o uso de enzimas imobilizadas como biossensores em aplicações biomédicas 36 ou como órgãos artificiais.…”