Influence of Iron Chelating Agents on the in Vitro Growth Curve of Corynebacterium pseudotuberculosis Strains

Abstract

Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente causador da linfadenite caseosa dos caprinos e ovinos, enfermidade associada a perdas econômicas diretas no setor pecuário. Além de ter um curso crônico, o seu tratamento com antibióticos é inviável e não existem vacinas eficazes disponíveis no mercado. Neste experimento, foram utilizadas condições de cultivo in vitro que se aproximassem do ambiente das condições in vivo encontradas pela bactéria durante a infecção do hospedeiro, isto incluiu a utilização de material biológico animal como meio de cultura e a restrição do ferro livre no meio. Nessas condições, era esperado que o C. pseudotuberculosis expressasse perfis proteicos de membrana ainda desconhecidos. Par isso foram utilizadas linhagens bacterianas de baixa (T1) e alta (VD57) virulência, cultivadas em caldo BHI, MQD, MQD suplementado com ferro, RPMI, RPMI suplementado com soro ovino e um meio produzido com material biológico ovino, todos estes com e sem suplementação de agentes quelantes de ferro. As massas bacterianas foram coletadas durante as fases Log e Estacionária da curva de crescimento da bactéria, para que fosse conduzida a extração das moléculas de membrana com o uso de solventes orgânicos. Este procedimento gerou uma fração denominada antígenos de membrana, rica em glicoproteínas. O perfil proteico variou de acordo com o meio utilizado, sendo que algumas bandas coradas na eletroforese aparecem em muitos meios. Portanto foi possível produzir informações importantes para uma futura vacina e produção testes diagnósticos. Palavras-chave: C. pseudotuberculosis. Meios de Cultura. Quelantes de Ferro. Proteínas de Membrana Bacteriana. Abstract Corynebacterium pseudotuberculosis is the causative agent of caseous lymphadenitis in goats and sheep, a disease associated with direct economic losses in the livestock sector. In addition to having a chronic course, its treatment with antibiotics is unfeasible and there are no effective vaccines available on the market. In this experiment, in vitro culture conditions that approximated the environment to the in vivo conditions found by the bacterium during host infection were used, this included the use of animal biological material as a culture medium and the restriction of free iron in the medium. Under these conditions, C. pseudotuberculosis was expected to express unknown membrane protein profiles yet. Also, bacterial strains of low (T1) and high (VD57) virulence were used, grown in BHI broth, MQD, MQD supplemented with iron, RPMI, RPMI supplemented with sheep blood serum and a culture medium produced with biological material, all of these with and without supplementation of iron chelating agents. Bacterial masses were collected during the Log and Stationary phases of the bacterial growth curve, so that membrane molecules could be extracted using organic solvents. This procedure generated a fraction called membrane antigens, rich in glycoproteins, with a protein profile varying among the different growth media tested, demonstrating the importance of the medium for bacterial protein expression and consequently influencing the expressed protein profile for test production diagnoses and a future vaccine. Keywords: C. pseudotuberculosis. Culture Medium. Iron Chelators. Bacterial Membrane Proteins.