Increased resolution of in situ hybridization signal by electron microscopy: A comparison with fluorescence microscopy

Abstract

Cytogenetic studies by in situ hybridization (ISH) have proven to be valuable for gene mapping on banded chromosomes when combined with fluorescence microscopy (FISH). However, even under the best conditions, FISH technology has a resolving power inherent to light of just 0.2 µm. Its utilization is further limited by the diffusion of light coming from the fluorescent signal which covers an area considerably larger than the target DNA sequence. The development of new ISH protocols applied to electron microscopy (EMISH) should increase the resolution for cytogenetic mapping and fine chromosomal structure studies. Despite these advances, few attempts have been made which exploit this increased resolution. Here we present a detailed analysis of ISH signals obtained by fluorescence and electron microscopy methodologies to demonstrate and define the higher sensitivity obtainable by electron microscopy. This comparative study was conducted with probes of different origins: telomeric, classical satellite, alpha satellite, and single-copy DNA sequences, which provide a good reference point for later studies. We were also able to map a 200-bp cDNA probe by EMISH. This study assesses the nature of the resolution and the better definition of the EMISH signal, which confirms the greater resolution of electron microscopy as compared with that achieved with light microscopy. It also indicates that better delineation of two closely linked sequences is achieved at the electron microscopy level.Résumé : L'analyse cytogénétique par hybridation in situ (ISH) sur chromosomes marqués, combinée à la fluorescence (FISH), s'est avérée très utile pour la cartographie génique. Toutefois, il faut tenir compte du fait que la technologie du FISH possède un pouvoir de résolution de seulement 0.2 µm, inhérent à la lumière, et cela même dans les meilleures conditions. Son utilisation est aussi limitée par la diffusion de la lumière émanant du signal fluorescent qui couvre une surface beaucoup plus grande que la séquence d'ADN cible. L'utilisation de la microscopie électronique en conjonction avec l'ISH constitue une technologie (EMISH) mieux adaptée à la cartographie à haute résolution et à l'analyse de la structure fine des chromosomes. Malgré l'instauration de cette nouvelle technologie, peu de recherches l'ont utilisée pour tirer parti de son plus grand pouvoir de résolution. Afin de mettre en évidence cette résolution augmentée, nous présentons ici la comparaison de résultats obtenus tant en fluorescence qu'en microscopie électronique avec des sondes de différents types: télomériques, satellites classiques, alpha satellites ainsi que des séquences de ADN simple copie. Nous avons même pu localiser avec EMISH une séquence de ADNc mesurant seulement 200 paires de bases. Cette étude confirme le meilleur niveau de résolution obtenu avec EMISH. La localisation est plus précise et deux séquences rapprochées peuvent être mieux circonscrites et donc situées plus exactement. Nous espérons que ce travail puisse servir de référence pour des travaux ulté...