In vivo investigation to the macrolide-glycosylating enzyme pair DesVII/DesVIII in Saccharopolyspora erythraea

Abstract

Glycosyltransferase DesVII and its auxiliary partner DesVIII from Streptomyces venezulae, homologs of EryCIII and EryCII in Saccharopolyspora erythraea, have previously been demonstrated to be flexible on their substrates in vitro. Herein, we investigated their in vivo function by interspecies complementation in the mutant strains of Sac. erythraea A226. As desVII and desVIII were concomitantly expressed in the ΔeryCIII mutant, the erythromycin A (Er-A) production was restored. Interestingly, co-expression of desVII and desVIII in the ΔeryBV mutant exhibited an increased Er-A yield by 15 % in comparison to A226. Hence, DesVII/DesVIII not only replaced EryCIII to upload D-desosamine to C5 position of 3-O-mycarosyl erythronolide B (MEB) but also in vivo attached L-mycarose, not D-desosamine to C3 position of erythronolide B (EB) with a higher activity than EryBV. Furthermore, expression of desVII in ΔeryCIII and ΔeryBV-CIII partially restored the Er-A production; however, no Er-A was detected while desVII was expressed in ΔeryBV. It was implicated that DesVII coupled with EryCII to form the DesVII/EryCII complex for attaching above two deoxysugars in the absence of EryCIII in Sac. erythraea. In addition, when desVII and desVIII were co-expressed in ΔeryBV-CII, Er-A was recovered with a lower yield than ΔeryBV-CIII. Our study presents an opportunity with Sac. erythraea as a cell factory for macrolide glycodiversification.

Determinação do papel estrutural que proteínas auxiliares exercem para ativação das glicosiltransferases na biossíntese de antibióticos macrolídeos.

“…Com o uso das glicosiltransferases, utilizam-se técnicas in vivo, na qual se emprega a recombinação gênica para deletar, substituir, ativar ou acrescentar genes em uma determinada espécie produtora de antibiótico, como já realizado com sucesso para os antibióticos macrolídeos eritromicina e pikromicina (JUNG et al, 2007;THIBODEAUX;MELANÇON;LIU, 2007;WU et al, 2016); e técnicas in vitro, que consiste na incubação da aglicona com diferentes doadores utilizando a enzima glicosiltransferase purificada, como realizado por Borisova et al (2006) para investigar a especificidade do par DesVII/DesVIII Existem ainda as técnicas na qual os aminoácidos do sítio ativo são mutados (THIBODEAUX; MELANÇON; LIU, 2007) ou a troca de domínios funcionais entre diferentes glicosiltransferases, gerando proteínas quimeras que podem aceitar tanto aceptores quanto doadores diferentes (TRUMAN et al, 2009). Várias pesquisas revelam que, as glicosiltransferases apresentam uma alta especificidade para 6-desoxi açúcares porém uma especificidade relaxada tanto para as moléculas doadoras, quanto para os aceptores.…”