Improvement of cellulose degradation by cloning of endo-β-1, 3-1, 4 glucanase (bgls) gene from Bacillus subtilis BTN7A strain

Abstract

The aim of this study is to construct a new recombinant strain able to degrade cellulose efficiently. The endo-β-1, 3-1, 4 glucanase (bgls) gene was cloned from Bacillus subtilis BTN7A strain by using PCR technique. The specific primers of bgls gene were deduced. Optimization of PCR mixture and program were identified. The nucleotide sequence of bgls was placed in the public domain (GenBank accession number KM009051.1). The obtained bgls DNA was cloned with pGEM®-T Easy Vector. The recombinant plasmid designated as Bgls-NRC-1 was transformed into E. coli DH5α. The successful cloning of the bgls gene was tested either by PCR or by evaluating its expression in its new bacterial host. The bgls gene was expressed efficiently in E. coli and the enzyme activity of the transformant was compared to the enzyme activity of the donor bacterial strain. The new constructs produce much higher enzyme yields than the donor bacterial strain, they produce about 29% and about 57% higher cellulase specific activity at 37 °C and 55 °C respectively. Optimization of cellulolytic activity of the new recombinant strain were described. The effect of minimal medium supplemented with CMC or cellulose, or complete medium (LB) on bgls expression were tested, the order of cellulase activity production was CMC27.2 > cellulose 21.9 > LB 19.8 U/mg protein, respectively at 24 h. CMC was proved to be the best medium for cellulase production. Results also showed that double the initial inoculum resulted in more cellulase activities in all media.

Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase solat Bacillus subtilis W3.15

“…Keberadaan gen penyandi β-glukanase dalam genom isolat bakteri W3.15 dideteksi berdasarkan metode Hegazy et al (2018). Amplifikasi gen penyandi β-glukanase dilakukan pada mesin PCR (Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler, USA), yang di program untuk satu siklus pertama (pre-denaturasi) pada suhu 95 °C selama dua menit, kemudian siklus selanjutnya dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut: denaturasi pada suhu 95 °C selama satu menit, penempelan primer pada suhu 52 °C selama satu menit, pemanjangan pada suhu 72 °C selama satu menit dan pasca pemanjangan pada suhu 72 °C selama lima menit kemudian campuran reaksi disimpan sementara pada suhu 4 °C.…”

“…Amplifikasi gen penyandi β-glukanase dilakukan pada mesin PCR (Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler, USA), yang di program untuk satu siklus pertama (pre-denaturasi) pada suhu 95 °C selama dua menit, kemudian siklus selanjutnya dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut: denaturasi pada suhu 95 °C selama satu menit, penempelan primer pada suhu 52 °C selama satu menit, pemanjangan pada suhu 72 °C selama satu menit dan pasca pemanjangan pada suhu 72 °C selama lima menit kemudian campuran reaksi disimpan sementara pada suhu 4 °C. Primer yang digunakan dalam deteksi gen β-glukanase pada isolat bakteri terpilih adalah primer reverse (5'-ATT GCA GCA GGC TCT TTC AC-3') dan primer forward (5'-AAT GAA AGG GGA ATG CCA AT-3') (Hegazy et al, 2018). Setelah proses amplifikasi gen bgls pada mesin PCR telah selesai, sebanyak 10 µL amplikon gen bgls dimigrasikan pada gel agarosa 1 % (b/v) yang telah ditambahkan 3 µL pewarna DNA peqgreen (PeqLab, Jerman) dengan cara elektroforesis pada tegangan 70 Volt selama 35 menit.…”

“…Keberadaan pita DNA berukuran ± 800 bp yang berada pada daerah pita sekitar 750 -1.000 bp dari marker DNA 1 kb menunjukkan hasil positif untuk keberadaan gen penyandi β-glukanase pada isolat bakteri W3.15. Hasil amplifikasi gen bgls tersebut kemudian dilakukan sekuensing melalui jasa sekuensing dengan menggunakan primer gen bgls berdasarkan referensi dari Hegazy et al (2018), yaitu reverse (5'-ATT GCA GCA GGC TCT TTC AC-3') dan primer forward (5'-AAT GAA AGG GGA ATG CCA AT-3').…”

“…Pita untuk amplikon gen bgls berhasil dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa yang berada pada ukuran yang sesuai dengan literatur primer. Hasil ini telah sesuai dengan laporan sebelumnya bahwa ukuran pita gen bgls dengan primer bglF-R (Loni et al, 2014) sekitar 777 bp (Hegazy et al, 2018). Ukuran pita untuk gen bgls dari isolat W3.15 juga ternyata tidak jauh berbeda dengan yang didapatkan oleh penelitian lainnya yakni sekitar 729 bp dengan primer BglsfosD9 (Gonçalves et al, 2020).…”

Rational Design of Disulfide Bonds Increases Thermostability of a β-1,3-1,4-Glucanase from Paenibacillus

“…It is the main polysaccharide constituting the endosperm cell wall of grain, and it is found in barley, wheat, sorghum, straw, and other plants (Wang et al 2014). Enzymes capable of degrading glucans are generally classi ed into three classes: β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), β-1,3 − 1,4-glucanase (EC 3.2.1.73) and β-1,3 (4)-glucanase (EC 3.2.1.6) (Hegazy et al 2018). Of these, β-1,3 − 1,4-glucanase plays an important role in the degradation of glucan, widely used in brewing and poultry feed industries (Bamforth 2017, Raveendran et al 2018).…”