Improved Titers of Retroviral Vectors from the Human FLYRD18 Packaging Cell Line in Serum- and Protein-Free Medium

Abstract

The influence of serum on the production of retroviral vectors by the HT1080 human fibrosarcoma-derived packaging cell line FLYRD18 was investigated. A fourfold increase in virus titer was observed under serum-free conditions, as compared with medium supplemented with 10% fetal calf serum. A similar improvement was also seen for bulk transduction efficiency. Serum had a negative and dose-dependent effect on titer without affecting cell growth, virus stability, or infectivity. In contrast to virus from NIH 3T3-derived packaging cells [Hanenberg, H., et al. (1996). Nature Med. 2, 876-882], the FLYRD18-derived virus did not adhere to fibronectin or serum proteins adsorbed at the surface of culture flasks. Electron microscopy supports the conclusion that the effect of serum is at the level of virus production by the cells. Addition of soybean trypsin inhibitor had an inhibitory effect on virus production, while pretreatment of serum with trypsin was found to enhance the retroviral titer. These results suggest that protease inhibitors present in serum may be responsible for the inhibition of virus production. The exact mechanism remains, however, to be determined. As compared with medium supplemented with 10% serum, the combination of increased virus titer and absence of exogenous protein under serum-free conditions resulted in a 300-fold increase in the virus:total protein ratio in the supernatants harvested from the FLYRD18 packaging line. This improvement enhances prospects for further concentration and purification of the virus.

Cell Culture Processes for the Production of Viral Vectors for Gene Therapy Purposes

“…Vector decay rates were comparable at both temperatures indicating that serum components were not responsible for virus inactivation (McTaggart 2000). The negative effect of serum was attributed to protease inhibitors present in serum, which have an adverse effect on virus assembly and budding (Gerin et al 1999a). While the different findings may be explained by the origin of the cell line (murine or human), it may also signify that serum has opposing roles; certain components are able to promote vector synthesis while other elements inhibit virus assembly.…”

Post-mitotic, differentiated myotubes efficiently produce retroviral vector from hybrid adeno-retrovirus templates

“…32 Furthermore, a number of groups have reported increased titres when incubating retroviral producer cells at lower temperatures or by reducing serum concentration, approaches that undoubtedly slow producer cell division. [32][33][34][35][36] However, the increases in retroviral vector titres using these approaches have previously been attributed to an increase in retrovirus stability at lower temperatures and easier isolation of retrovirus from medium containing lower serum concentrations.…”

Expressão gênica empregando pseudopartículas em células de mamíferos (HEK 293T e Huh 7.0) cultivadas em diferentes meios de cultura livres de soro.

“…Como dito anteriormente, os SFM estão sendo utilizada para várias finalidades, entre elas produção de vacinas (GERIN et al, 1999;HAYTER et al, 1992;MERTEN et al, 1994;PERRIN et al, 1995). Tipicamente, adaptação livre de soro consiste na substituição de componentes do soro, por nutrientes bem definidos.…”

“…Por outro lado, estratégias alternativas de expressão gênica têm surgido, algumas se utilizando de diferentes vírus para a produção de partículas semelhantes às partículas virais (TAN, 2006 Os SFM já estão sendo utilizados na produção de anticorpos monoclonais, vacinas e outros produtos biológicos (GERIN et al, 1999;HAYTER et al, 1992;MERTEN et al, 1994;PERRIN et al, 1995) ou ainda cultivos de células com outras finalidades (DENK; WUNDERLICH; KNORR, 1998;RUNGE et al, 2000;SAKODA et al, 1998).…”

“…Os protocolos mais comumente usados para adaptar células para meios livres de soro (SFM) incluem adaptação direta e sequencial (SCHRODER et al, 2004;SINACORE et al, 2000). Após o processo de adaptação é essencial a avaliação do desempenho das linhagens nos diferentes meios de cultura, quantificando os nutrientes remanescentes, como a glicose e a glutamina, os metabólitos formados, como o lactato e amônio, além da concentração do produto de interesse, se for o caso (FRESHNEY, 2005).Por outro lado, estratégias alternativas de expressão gênica têm surgido, algumas se utilizando de diferentes vírus para a produção de partículas semelhantes às partículas virais (TAN, 2006 Os SFM já estão sendo utilizados na produção de anticorpos monoclonais, vacinas e outros produtos biológicos (GERIN et al, 1999;HAYTER et al, 1992;MERTEN et al, 1994;PERRIN et al, 1995) ou ainda cultivos de células com outras finalidades (DENK; WUNDERLICH; KNORR, 1998;RUNGE et al, 2000;SAKODA et al, 1998).No caso do aspecto científico, a substituição do soro conduziria a uma melhor qualidade e reprodutibilidade dos dados experimentais (BALLS et al, 2006;COECKE et al, 2005; HARTUNG et al, 2002). Além disso, o desenvolvimento dos SFM e de proteína animal são de extrema importância não só para aumentar a segurança dos produtos biológicos produzidos para terapia e vacinação, como também para minimizar as etapas downstream de extração e purificação dos produtos, barateando o processo.…”