Impact of operating conditions on chromatographic column performance: experimental studies on adsorption of high-value minor whey proteins

Faraji, Naeimeh; Zhang, Yan; Ray, Ajay K.

doi:10.3934/bioeng.2017.2.223

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“…Conforme la fase móvil se mueva más rápidamente a través de la columna y más lenta sea la transferencia de masa, más ancho será el pico de elución. De manera general la ecuación de Van Deemter adopta la siguiente forma, mostrada en la Figura 15 [45,47,149,161].…”

Section: Eficiencia De La Operación Cromatográficaunclassified

“…Para caracterizar la operación se estudió a pequeña escala (columna XK 26/40) la relación de número de platos teóricos (HEPT) respecto al flujo de operación (v), con el objetivo de conocer la región de la gráfica de Van Deemter para el sistema cuando se utiliza la resina del tipo Sephadex-G25 Medium para una operación de CEM [47]. Para conocer la distribución de los flujos de operaciones y su relación con la eficiencia del proceso de transferencia de masa, se utilizará una metodología similar a la descrita por Faraji y colaboradores [45], acetona al 3% se empleará como analito traza capaz de penetrar los poros de la resina (excluyente para pesos moleculares de 5000 Da). Para este estudio la velocidad lineal máxima evaluada será de 200 cm.h -1.…”

Section: Caracterización Del Sistema Cromatográficounclassified

“…Para ejecutar las corridas experimentales, se utilizará una metodología similar a la propuesta por Faraji y colaboradores [45], en la cual se emplea tampón fosfato salino (PBS) ajustando el pH a 6,7 con NaCl 1 mol.L -1 . Los experimentos se realizarán en un equipo ÄKTA purifier 100 system (GE Healthcare Life Sciencies), con un sistema de doble-bomba y múltiple monitoreo de señal que permitirá realizar ensayos simultáneos.…”

Section: Caracterización Del Sistema Cromatográficounclassified

“…La implementación de estas operaciones es realizada muchas veces a partir de ensayo y error o análisis puramente empírico que no describe el comportamiento dinámico del sistema, generando así, demoras sustanciales en el desarrollo de péptidos con actividad biológica definida y niveles de pureza requeridos (≤ 95%), todo esto, a expensas de un elevado costo operacional. De hecho, se ha estimado que alrededor del 70% de los costos de producción en los procesos recombinantes están asociados a etapas de purificación [43][44][45], motivo por el cual estas operaciones deben ser cuidadosamente estudiadas para no incurrir en diseños que afecten la factibilidad del proceso. La problemática se agudiza, cuando se busca establecer operaciones de purificación para péptidos novedosos, sin conocer al menos información básica sobre la talla molecular, punto isoeléctrico y coeficiente de extinción [12,44].…”

Section: Introductionunclassified

“…Deemter[45,47]. Luego, mediante herramientas de diseño experimental, será investigada la influencia de los principales factores operacionales sobre las variables respuestas de mayor relevancia.…”

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Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

Sánchez Ramos,

Zaror Zaror

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El Factor de Necrosis Tumoral (TNF; de sus siglas en inglés, tumor necrosis factor), se ha transformado en una importante diana terapéutica para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios. A la fecha, existen 5 biofármacos bloqueadores de TNF aprobados por la FDA que corresponden a proteínas de fusión y anticuerpos monoclonales. A pesar de los resultados terapéuticos informados, estos biofármacos poseen desventajas que limitan su uso, entre ellas: (i) deben ser producidos en cultivos de células de mamíferos, a un elevado costo de producción, (ii) son moléculas considerablemente grandes (~150 kDa), lo que limita la penetración de tejidos y condiciona el uso de altas dosis, (iii) tienen altos precios de mercado (~100 000 dólares/año, para una terapia individual), lo que implica que menos del 10% de los pacientes tenga acceso a este tipo de terapia. Para solucionar estas limitaciones, el Laboratorio de Biofármacos Recombinantes (LBR), de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Concepción, empleando la tecnología de Phage Display, ha desarrollado un péptido de unión a TNF (CBB288) con capacidad bloqueadora. Los péptidos, como potenciales bioactivos, suelen ser selectivos, poco tóxicos, y con un tamaño molecular (≤5 kDa) que permite el uso a bajas dosis respecto a los anticuerpos monoclonales. Como limitante, es conocido que existe una escasa optimización de operaciones a escala industrial para sintetizar péptidos, resultando la síntesis química de péptidos en un proceso caro y poco sustentable que genera un exceso de residuos tóxicos. En este marco, el avance de la biotecnología ofrece variantes con buena combinación de costo-sustentabilidad, donde sobresale la expresión de proteínas en Escherichia coli. En este trabajo, tres etapas fundamentales fueron establecidas para producir el r-CBB288, en una primera etapa de fermentación se expresaron copias repetidas del CBB288 en forma de tándem, luego, para obtener el péptido recombinante se realizó una proteólisis asistida con hidroxilamina (HX) y posteriormente para purificar el péptido se utilizó una cromatografía de exclusión molecular (CEM). Las tres operaciones se evaluaron mediante diseño experimental para analizar la influencia de los principales parámetros operacionales sobre las variables respuestas más importantes. En el caso de la CEM, resulta válido aclarar que las operaciones de purificación en los procesos biotecnológicos constituyen alrededor del 70% del costo total de producción, motivo por el cual estas operaciones deben ser optimizadas con rigor, para evitar afectaciones en la factibilidad del proceso. En este sentido, para la CEM se desarrolló un modelo fenomenológico que permite describir la operación e inferir el comportamiento a dimensiones requeridas. Para demostrar que el r-CBB288 conserva la capacidad unirse al TNF, ensayos de Termoforesis en Microescala (TMS) determinaron las constantes de disociación (Kd) respecto a la diana molecular. Además, ensayos MTT se llevaron a cabo para demostrar el bloqueo de la actividad citotóxica del TNF. Por otra parte, se demostró que la alternativa del péptido sintético no presenta diferencias respecto a su homólogo recombinante en cuanto a afinidad, para esto se realizó un estudio de simulación in silico desarrollado mediante dinámica molecular. Finalmente, un análisis técnico-económico del proceso se ejecutó mediante la herramienta de simulación computacional SuperPro Designer. Los resultados obtenidos sugieren que el péptido diseñado previamente CBB288 puede ser obtenido a partir de un proceso recombinante y utilizado en futuros estudios biomédicos relacionados con las patologías de inflamación crónicas.

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Section: Eficiencia De La Operación Cromatográficaunclassified

Section: Caracterización Del Sistema Cromatográficounclassified

Section: Introductionunclassified

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Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

Sánchez Ramos,

Zaror Zaror

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Application of Ion Exchange and Adsorption Techniques for Separation of Whey Proteins from Bovine Milk

Radosavljević

Stanić-Vučinić

Stojadinovic

et al. 2021

CAC

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Background: The world production of whey was estimated to be more than 200 million tons per year. Although whey is an important source of proteins with high nutritional value and biotechnological importance, it is still considered as a by-product of the dairy industry with low economic value due to low industrial exploitation. There are several challenges in the separation of whey proteins: low concentration, the complexity of the material and similar properties (pI, molecular mass) of some proteins. Methods: A narrative review of all the relevant papers on the present methodologies based on ion-exchange and adsorption principles for isolation of whey proteins, known to the authors, was conducted. Results: Traditional ion-exchange techniques are widely used for the separation and purification of the bovine whey proteins. These methodologies, based on the anion or cation chromatographic procedures, as well as combination of aforementioned techniques are still preferential methods for the isolation of the whey proteins on the laboratory scale. However, more recent research on ion exchange membranes for this purpose has been introduced, with promising potential to be applied on the pilot industrial scale. Newly developed methodologies based either on the ion-exchange separation (for example: simulated moving bed chromatography, expanded bed adsorption, magnetic ion exchangers, etc.) or adsorption (for example: adsorption on hydroxyapatite or activated carbon, or molecular imprinting) are promising approaches for scaling up of the whey proteins’ purification processes. Conclusion: Many procedures based on ion exchange are successfully implemented for separation and purification of whey proteins, providing protein preparations of moderate-to-high yield and satisfactory purity. However, the authors anticipate further development of adsorption-based methodologies for separation of whey proteins by targeting the differences in proteins’ structures rather than targeting the differences in molecular masses and pI. The complex composite multilayered matrices, including also inorganic components, are promising materials for simultaneous exploiting of the differences in the masses, pI and structures of whey proteins for the separation.

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Impact of operating conditions on chromatographic column performance: experimental studies on adsorption of high-value minor whey proteins

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Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

Application of Ion Exchange and Adsorption Techniques for Separation of Whey Proteins from Bovine Milk

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