High-Throughput Screening Assay for Laccase Engineering toward Lignosulfonate Valorization

Abstract

Lignin valorization is a pending issue for the integrated conversion of lignocellulose in consumer goods. Lignosulfonates (LS) are the main technical lignins commercialized today. However, their molecular weight should be enlarged to meet application requirements as additives or dispersing agents. Oxidation of lignosulfonates with fungal oxidoreductases, such as laccases, can increase the molecular weight of lignosulfonates by the cross-linking of lignin phenols. To advance in this direction, we describe here the development of a high-throughput screening (HTS) assay for the directed evolution of laccases, with lignosulfonate as substrate and the Folin–Ciocalteau reagent (FCR), to detect the decrease in phenolic content produced upon polymerization of lignosulfonate by the enzyme. Once the reaction conditions were adjusted to the 96-well-plate format, the enzyme for validating the assay was selected from a battery of high-redox-potential laccase variants functionally expressed in S. cerevisiae (the preferred host for the directed evolution of fungal oxidoreductases). The colorimetric response (absorbance at 760 nm) correlated with laccase activity secreted by the yeast. The HTS assay was reproducible (coefficient of variation (CV) = 15%) and sensitive enough to detect subtle differences in activity among yeast clones expressing a laccase mutant library obtained by error-prone PCR (epPCR). The method is therefore feasible for screening thousands of clones during the precise engineering of laccases toward valorization of lignosulfonates.

Evolved Fusarium oxysporum laccase expressed in Saccharomyces cerevisiae

“…The laccase was subjected to protein engineering in order to enhance its expression and its activity towards a redox mediator (DMP) that would improve brown coal modification by the enzyme. pH 5 was chosen as a condition for screening, as most processes of bioconversion of lignocellulose prefer pH 5 and the new laccase could find then application not only in brown coal biodegradation but also in biorefinery development [18][19][20][21] .…”

Alternatives for Chemical and Biochemical Lignin Valorization: Hot Topics from a Bibliometric Analysis of the Research Published During the 2000–2016 Period

“…Even simpler enzymatic options have been proposed for the valorization of traditional technical lignin. Kraft lignin or lignosulphonates can be polymerized (or co-polymerized with auxiliary monomers) by laccases to increase their molecular weight and meet application requirements as additives or dispersing agents [423][424][425][426].…”

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“…Mediante evolución molecular dirigida o diseño racional se han obtenido enzimas recombinantes con propiedades catalíticas y/o estabilidad mejoradas. Las aproximaciones experimentales se han combinado con el diseño computacional para profundizar en el conocimiento estructura-función de dichas enzimas y al mismo tiempo contribuir al desarrollo de enzimas a la carta como biocatalizadores de reacciones de interés industrial (Pardo et al, 2016;Sáez-Jiménez et al, 2016;Fernández-Fueyo et al, 2018). Además, estudios genómicos y secretómicos de especies de hongos cuyos genomas se han secuenciado recientemente han confirmado el papel clave de las peroxidasas en la biodegradación de la lignina, fijando su origen en el Carbonífero, coincidiendo con el descenso en la acumulación de carbón en la tierra a finales de este periodo geológico (Floudas et al, 2012).…”

“…En este contexto, si bien durante años la lignina era "el enemigo a abatir", en los últimos años la valorización de las fracciones ricas en lignina que se generan como subproductos en la producción de bioetanol celulósico y de la industria papelera es un objetivo (bio)tecnológico prioritario. Es por eso, que uno de nuestros intereses actuales se centra en la conversión de las ligninas derivadas de la industria en productos de valor añadido (Rodríguez-Escribano et al, 2017) El Grupo de Investigación Microbiología y Tecnología Ambiental RNM270, dirigido por el profesor D. Jesús González López, ha mantenido desde sus inicios un marcado carácter multidisciplinar dentro del Área de Tecnologías del Medio Ambiente, estando formado por miembros de los Departamentos de Microbiología e Ingeniería Civil de la Universidad de Granada, la mayoría de ellos investigadores del Instituto de Investigación del Agua de esta Universidad. Así, la apuesta por la investigación y la transferencia de conocimiento a la sociedad y al tejido industrial ha posicionado al grupo como un referente internacional dentro del estudio del ciclo integral del agua, abarcando tanto aspectos microbiológicos como relativos a la gestión, calidad y tratamiento.…”

“…Este mecanismo de regulación se ha estudiado ampliamente en bacterias modelo, tales como Escherichia coli y Bacillus subtillis, pero muy poco en otras que son de interés medioambiental como las pertenecientes a la familia Sphingomonadaceae. Sphingopyxis granuli estirpe TFA es una bacteria oligotrofa perteneciente a la familia anterior cuyo genoma se ha secuenciado recientemente (García-Romero et al, 2016). Una de las principales características metabólicas de esta bacteria es su capacidad para mineralizar la tetralina al utilizarla como única fuente de carbono y energía.…”