High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number

Hindson, Benjamin J.; Ness, Kevin; Masquelier, Donald A; Belgrader, Phillip; Heredia, Nicholas J.; Makarewicz, Anthony J.; Bright, Isaac J.; Lucero, Michael; Hiddessen, Amy L.; Legler, Tina C.; Kitano, Tyler K.; Hodel, Michael R.; Petersen, Jonathan F.; Wyatt, Paul W.; Steenblock, Erin R.; Shah, Pallavi H.; Bousse, Luc; Troup, Camille; Mellen, Jeffrey C.; Wittmann, Dean K.; Erndt, Nicholas G.; Cauley, Thomas H.; Koehler, Ryan T.; So, Austin P.; Dube, Simant; Rose, Klint A.; Montesclaros, Luz; Wang, Shenglong; Stumbo, D. P.; Hodges, Shawn P.; Romine, Steven; Milanovich, Fred P.; White, Helen; Regan, John F.; Karlin-Neumann, George; Hindson, Christopher M.; Saxonov, Serge; Colston, Bill W.

doi:10.1021/ac202028g

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“…[23][24][25] Unlike conventional MethyLight PCR, the droplets in MethyLight ddPCR are cycled to endpoint and each droplet is read as positive or negative. 15 Thus, amplification efficiency is less of a concern in MethyLight ddPCR compared to conventional MethyLight PCR. Poisson statistics are used to accurately determine the absolute number of starting copies of methylated alleles.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles

Carter

Makar

et al. 2015

Epigenetics

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Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles

Carter

Makar

et al. 2015

Epigenetics

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“…We used droplet digital PCR (ddPCR) (34) to confirm independently a subset of the heteroplasmies observed via sequencing. Briefly, the method involves setting up a conventional PCR assay in a 20-μL volume with target DNA, primers, polymerase, nucleotides, buffer, and two allele-specific probes (one for each allele at the position of interest) labeled with different fluorescent tags.…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Extensive tissue-related and allele-related mtDNA heteroplasmy suggests positive selection for somatic mutations

Schröder

et al. 2015

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

185

278

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Heteroplasmy in human mtDNA may play a role in cancer, other diseases, and aging, but patterns of heteroplasmy variation across different tissues have not been thoroughly investigated. Here, we analyzed complete mtDNA genome sequences at ∼3,500× average coverage from each of 12 tissues obtained at autopsy from each of 152 individuals. We identified 4,577 heteroplasmies (with an alternative allele frequency of at least 0.5%) at 393 positions across the mtDNA genome. Surprisingly, different nucleotide positions (nps) exhibit high frequencies of heteroplasmy in different tissues, and, moreover, heteroplasmy is strongly dependent on the specific consensus allele at an np. All of these tissue-related and allele-related heteroplasmies show a significant age-related accumulation, suggesting positive selection for specific alleles at specific positions in specific tissues. We also find a highly significant excess of liver-specific heteroplasmies involving nonsynonymous changes, most of which are predicted to have an impact on protein function. This apparent positive selection for reduced mitochondrial function in the liver may reflect selection to decrease damaging byproducts of liver mitochondrial metabolism (i.e., "survival of the slowest"). Overall, our results provide compelling evidence for positive selection acting on some somatic mtDNA mutations.mtDNA | heteroplasmy | selection | human | tissue variation

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“…Deux études, parues en 2011, présentent des technologies de dPCR utilisant des systèmes microfluidiques en microgouttelettes : l'une pour la détection de mutations de BRaf (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B) avec une sensibilité de 0,001 % (soit un clone muté détecté parmi 100 000 clones non mutés) [28], et l'autre pour la détection de mutations de KRas avec une sensibilité similaire [29], suffisante pour la détection de mutations de KRas dans l'ADN libre circulant. Basée sur cette dernière technique, une procédure en multiplex permettant de détecter et de quantifier les sept mutations de KRas les plus répandues a été dévelop-pée et utilisée pour caractériser l'ADN libre tumoral circulant plasmatique de patients atteints de cancer colorectal à un stade avancé (analyse faite lors de la progression tumorale et avant le début du traitement anti-EGFR).…”

Section: Caractérisation Des Altérations Génétiquesunclassified

PCR digitale en micro-compartiments

et al. 2015

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> La recherche d'altérations génétiques dans les cellules tumorales fait partie de la prise en charge des patients atteints de cancer. L'analyse de l'ADN libre tumoral circulant dans les fluides biologiques, dont le sang, pourrait permettre le dépistage précoce de la maladie, la gestion thérapeutique des patients et la détection de récidives. Cet ADN libre tumoral, décrit comme représentatif de l'hétérogénéité tumorale, peut être retrouvé dans le sang dans des proportions faibles et variables selon la nature et la progression de la tumeur. Son analyse nécessite des méthodes à la fois très sensibles, spécifiques et quantitatives. Ces exigences représentaient une limite technologique que les récentes avancées de la PCR (polymerase chain reaction) digitale devraient permettre de dépasser. < tumeurs à l'échelle moléculaire, sont particulièrement pertinents dans le domaine de la médecine de précision. En effet, de nombreux traitements ciblés ont été développés ces dix dernières années, et de nouveaux marqueurs de sensibilité ou de résistance à ces traitements mis en évidence. Le suivi au cours du temps de ces altérations génétiques permettrait de suivre l'évolution du cancer, l'efficacité d'un traitement ou de détecter une éventuelle récidive. L'utilisation pleinement efficace de ces marqueurs en oncologie clinique nécessite cependant des méthodes précises et fiables pour les détecter dans différents types d'échantillons (biopsies tumorales, fluides biologiques dont le sang). L'avancée technologique récente que représente la PCR (polymerase chain reaction) digitale (dPCR) en microcompartiments permet la détection et la quantification de séquences rares avec une sensibilité et une précision hors de portée des procédures conventionnelles [43] (➜). La dPCR a ainsi récemment émergé comme un outil extrêmement prometteur pour le suivi non invasif de marqueurs géné-tiques, particulièrement pertinent pour la recherche en cancérologie. Caractéristiques de l'ADN libre circulant et contraintes liées à sa mesureDes acides nucléiques sont retrouvés dans l'ensemble des fluides biologiques dont le sang, les urines, les selles, la salive ou le liquide Le développement et la démocratisation des techniques de biologie moléculaire ont permis d'importants progrès dans la détection et l'analyse des acides nucléiques. Ces techniques constituent aujourd'hui un outil clé de la prise en charge des patients atteints de cancer. En effet, des réseaux complexes d'altérations génétiques ont été mis en évidence dans la plupart des cancers. Il peut s'agir, entre autres, de délétions, de mutations ponctuelles, de réarrangements chromosomiques ou d'amplifications. Ces altérations génétiques étant présentes uniquement dans les cellules tumorales, elles représentent des marqueurs spécifiques de cancer. Ces marqueurs peuvent être classés en trois grandes catégories : il peut s'agir de marqueurs diagnostiques, permettant, par exemple, de déterminer la localisation de la maladie ou son stade ; de marqueurs pronostiques, permettant de détecter la progressi...

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High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number

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MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles

MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles

Extensive tissue-related and allele-related mtDNA heteroplasmy suggests positive selection for somatic mutations

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