Growth Responses Following a Single Intra-Muscular hGH Plasmid Administration Compared to Daily Injections of hGH in Dwarf Mice

Abstract

In previous work, sustained levels of circulating human growth hormone (hGH) and a highly significant weight increase were observed after electrotransfer of naked plasmid DNA (hGH-DNA) into the muscle of immunodeficient dwarf mice (lit/scid). In the present study, the efficacy of this in vivo gene therapy strategy is compared to daily injections (5 μg/twice a day) of recombinant hGH (r-hGH) protein, as assessed on the basis of several growth parameters. The slopes of the two growth curves were found to be similar (P > 0.05): 0.095 g/mouse/d for protein and 0.094 g/mouse/d for DNA injection. In contrast, the weight increases averaged 35.5% (P < 0.001) and 23.1% (P < 0.01) for protein and DNA administration, respectively, a difference possibly related to the electroporation methodology. The nose-to-tail linear growth increases were 15% and 9.6% for the protein and DNA treatments, respectively, but mouse insulin-like growth factor I (mIGF-I) showed a greater increase over the control with DNA (5- to 7-fold) than with protein (3- to 4-fold) administration. The weight increases of several organs and tissues (kidneys, spleen, liver, heart, quadriceps and gastrocnemius muscles) were 1.3- to 4.6-fold greater for protein than for DNA administration, which gave a generally more proportional growth. Glucose levels were apparently unaffected, suggesting the absence of effects on glucose tolerance. A gene transfer strategy based on a single hGH-DNA administration thus appears to be comparable to repeated hormone injections for promoting growth and may represent a feasible alternative for the treatment of growth hormone deficiency.

Otimização de parâmetros de transferência <i>in vivo</i> do gene do hormônio de crescimento visando a correção fenotípica de camundongos anões

“…O emprego desta técnica no músculo e na pele tem demonstrado resultados satisfatórios com vários genes, entre eles o da eritropoietina (Epo), do hormônio liberador de hormônio do crescimento (GHRH) e do hormônio de crescimento humano (hGH) e murino (mGH) (Rizzuto et al, 1999;Fattori et al, 2005;Prud´homme et al, 2006;Miyazaki & Miyazaki, 2008;Brown et al, 2009;Khan et al, 2010;Oliveira et al, 2010;Higuti et al, 2012;Cecchi et al, 2014;Higuti et al, 2016).…”

“…A curva dos animais tratados apresentou uma diferença altamente significativa (P< 0,0001) em relação à curva dos controles. (Oliveira et al, 2010;Higuti et al, 2012;Cecchi et al, 2014). Neste trabalho foi realizada uma comparação entre a utilização do músculo quadríceps exposto e o tibial anterior não exposto, utilizando também duas condições de eletrotransferência: 8 pulsos de 150 V/cm e 20 ms, com intervalo de 0,5s (utilizada nos trabalhos prévios) ou 1 pulso de 800 V/cm e 100 µs e 1 pulso de 10 V/cm e 400 ms, denominada HV/LV.…”

“…Em outro trabalho (Wang et al, 2005), foi verificado que a injeção da mesma quantidade do plasmídeo injetada em dois locais do músculo, proporcionou aumentos significativos nos níveis de expressão de leptina. Gardiner et al (2006) (Higuti et al, 2012;Cecchi et al, 2014;Higuti et al, 20160 Ao analisarmos os níveis de mGH na circulação dos camundongos lit/lit ao final do bioensaio de 36 dias (8,5 ± 2,3 ng/mL), verificamos que são da ordem de 2 vezes mais elevadas que os obtidos anteriormente (Cecchi et al, 2014). Estes níveis podem ser considerados da mesma ordem dos valores mais elevados de hGH obtidos até o momento, que foram de ~ 6,7 ± 1,2 ng hGH/mL em camundongos lit/scid (Higuti et al, 2016 A utilização de outras metodologias de transferência gênica já proporcionou uma completa normalização dos níveis de IGF-I e do peso corpóreo.…”

Comparação de eficiência entre vetores contendo a sequência genômica e complementar, acrescida ou não da região downstream, do hormônio de crescimento humano na terapia gênica

“…Esse tipo de tratamento possui potenciais vantagens em relação ao tratamento com r-hGH como, por exemplo, diminuir o número de injeções que o paciente precisa receber ao longo de sua vida, evitar o trabalhoso e dispendioso processo de purificação do hormônio (o que poderia diminuir os custos totais do tratamento), além de proporcionar um método de liberação do hormônio mais próximo ao natural, uma vez que a produção de GH ocorrerá pelas células do próprio paciente. A terapia gênica é, portanto, um procedimento mais seguro e possivelmente mais barato, no qual ocorre apenas a entrega de moléculas de DNA, sem a necessidade de utilizar outros adjuvantes químicos como conservantes e estabilizantes, além de haver a possibilidade do mecanismo de liberação da proteína ser mais próximo do fisiológico (Khamaisi et al, 2007;Zaninelli et al, 2008;Oliveira et al, 2010;Higuti et al, 2012;Wang et al, 2013, Cervia et al, 2018.…”

“…Possuem geralmente algumas regiões em comum, sendo elas: O gene que será expresso; o promotor que regulará a expressão desse gene; um gene marcador de seleção, o qual permitirá escolher colônias de bactérias que possuem o plasmídeo em detrimento àquelas que não possuem; e um sítio de origem de replicação (Figura 3), o qual permitirá que esse plasmídeo seja clonado em larga escala em bactérias e posteriormente purificado em sistemas específicos para clonagem de material genético. Nos nossos trabalhos de terapia gênica, temos utilizado atualmente plasmídeos contendo as sequências genômicas do GH humano ou murino, regulados pelo promotor da Ubiquitina-C (UBI) (Oliveira et al, 2010;Higuti et al, 2012;Cecchi et al, 2014;Higuti et al, 2016;Cecchi et al, 2017).…”