Genetic Code Expansion Facilitates Position‐Selective Modification of Nucleic Acids and Proteins

Müller, Diana; Trucks, Sven; Schwalbe, Harald; Hengesbach, Martin

doi:10.1002/cplu.202000150

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“…However, the large 19 F CSA has affected in-cell 19 F-NMR sensitivity and line width until now (sections and ). Advanced isotope-labeling schemes, introducing 13 C– 19 F pairs, may be useful for in-cell NMR studies in the future. ,,,, Genetic code expansion may also be useful to introduce single non-natural amino acids with favorable NMR characteristics. ,, …”

Section: Integrating In-cell Nmr In the Field Of In-cell Structural B...mentioning

confidence: 99%

“…118,119,137,139,417 Genetic code expansion may also be useful to introduce single non-natural amino acids with favorable NMR characteristics. 120,950,951 We feel that the approaches using in situ production of the analyzed proteins would favor biologists' trust. Electroporation delivery has been shown to permit functional behavior of the transduced objects, even of complex macromolecules.…”

Section: The Future Technical Challenges Of In-cell Nmrmentioning

confidence: 99%

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In-Cell Structural Biology by NMR: The Benefits of the Atomic Scale

Theillet

2022

Chem. Rev.

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In-cell structural biology aims at extracting structural information about proteins or nucleic acids in their native, cellular environment. This emerging field holds great promises and is already providing new facts and outlooks of interest at both fundamental and applied levels. NMR spectroscopy has important contributions on this stage: it brings information on a broad variety of nuclei at the atomic scale, which ensures its great versatility and uniqueness. Here, we detail the methods, the fundamental knowledge and the applications in biomedical engineering related to in-cell NMR. We finally propose a brief overview of the main other techniques in the field (EPR, smFRET, cryo-ET…) to draw some advisable developments for in-cell NMR. In the era of large-scale screenings and deep learning, both accurate and qualitative experimental evidences are as essential as ever to understand the interior life of cells. In-cell structural biology by NMR spectroscopy can generate such a knowledge, and it does so at the atomic scale. This review is meant to deliver comprehensive but accessible information, with advanced technical details and reflections on the methods, the nature of the results and the future of the field. CONTENTS 5.1.1. In-cell EPR 5.1.2. In-cell FRET microscopy 5.1.3. Mass-spectrometry 5.1.4. Cryo-ET 5.2. The specific benefits of in-cell NMR 5.3. The future technical challenges of in-cell NMR 6. Conclusion Author Information

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Section: The Future Technical Challenges Of In-cell Nmrmentioning

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In-Cell Structural Biology by NMR: The Benefits of the Atomic Scale

Theillet

2022

Chem. Rev.

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“…Dabei sind die Synthesen zusätzlich in verhältnismäßig kurzer Zeit möglich. Sequenzlängen von bis zu etwa 150 Nukleotiden [78,79] im Falle von DNA können erreicht werden. Durch die verringerte Kupplungsausbeute können RNAs hingegen nur bis zu einer Länge von etwa 70-100 Nukleotiden [12,64,[80][81][82][83] synthetisiert werden.…”

Section: Chemische Synthese Modifizierter Nukleinsäurenunclassified

“…3A). [78,[97][98][99] Unter anderen wendeten Domnick et al diese Methode an, um mittels in vitro Transkription unnatürliche Spingelabelte [87] (TPT3 NO ) oder Norbornen-Triphosphate [100] (Nor-UB) in RNAs einzufügen (siehe Abb. 3B).…”

Section: (Chemo-) Enzymatische Synthese Modifizierter Rnaunclassified

Chemo-enzymatische Synthese lichtaktivierbarer RNA & Synthese lichtregulierbarer Oligonukleotide zur spektroskopischen Strukturaufklärung

Blümler¹

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Das wachsende Verständnis für das fein abgestimmte Zusammenspiel aus Struktur und Funktion von Nukleinsäuren resultiert aus unzähligen Forschungsprojekten. Forschende stehen dabei vor der Herausforderung, dass die zu untersuchenden Oligonukleotide sowohl modifiziert als auch in ausreichender Menge und Reinheit dargestellt werden müssen. Die chemische Festphasensynthese ist ein bewährtes Mittel zur Synthese hochmodifizierter DNA und RNA. Allerdings werden Oligonukleotide mit zunehmender Länge unzugänglicher, da die einzelnen Kupplungsreaktionen nicht quantitativ ablaufen, was zu schwer abtrennbaren Abbruchsequenzen führt. Hinzu kommt, dass während der chemischen Synthese harsche Reaktionsbedingungen nötig sind, denen die gewünschten Modifikationen standhalten müssen. (Chemo-) enzymatische Methoden können diese Hürden überwinden und somit den Zugang zu biologisch interessanten, längeren modifizierten Sequenzen ermöglichen. Jedoch erfolgt der enzymatische Einbau von Modifikationen ohne aufwendige Optimierung lediglich statistisch verteilt. Um weitere Erfolge im Bereich der Strukturaufklärung zu erzielen, werden somit Synthesemethoden benötigt, die sich zum positionsspezifischen Einbau von Modifikationen eignen und gleichzeitig den Zugang zu längeren Oligonukleotiden ermöglichen. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion haben sich in den letzten Jahren lichtadressierbare Verbindungen als gefragte Modifikationen erwiesen. Der Einsatz von Licht als mildes, nicht-invasives Auslösesignal stellt besonders im biologischen Kontext eine interessante Herangehensweise dar. Um hochwertige Aussagen über das Verhalten von Oligonukleotiden in komplexer biologischer Umgebung machen zu können, muss durch die gezielte Platzierung lichtaktivierbarer Verbindungen ein effizientes AN/AUS-Verhältnis geschaffen werden. Der Einbau photolabiler Schutzgruppen erlaubt eine vorübergehende Beeinflussung der Oligonukleotidstruktur, die durch Abspaltung der Schutzgruppe irreversibel (re-) aktiviert werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einbau von Photoschaltern eine reversible Adressierbarkeit durch Isomerisierungsprozesse. Die Synthese komplexer gezielt-markierter Oligonukleotide erfolgt zumeist chemisch und ist daher längenlimitiert. Ziel dieser Doktorarbeit war es, beide Fragestellungen zu vereinen und eine chemo-enzymatische Methode zur RNA-Synthese zu untersuchen, die zum einen die positionsspezifische Modifizierung mit lichtaktivierbaren Einheiten erlaubt und darüber hinaus die Längenlimitierung der chemischen Festphasensynthese überkommt. Im Zentrum der Methode stehen drei enzymatische Reaktionsschritte zum Einbau von photolabil- und photoschaltbar-modifizierten Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphaten: I) eine 3‘-Verlängerung, in der die modifizierten Bisphosphate mit T4 RNA Ligase 1 mit dem 3‘-Ende einer RNA verknüpft werden; II) die Dephosphorylierung des 3‘-Phosphats mit Shrimp Alkaline Phophatase und III) die Verknüpfung der 3‘-terminal modifizierten RNA mit einem zweiten 5‘-phosphorylierten RNA-Fragment, wodurch eine Gesamtsequenz mit gezielt platzierter Modifikation entsteht (Abb. I). Im ersten Teilprojekt wurden in kollaborativer Arbeit zunächst benötigte photolabile NPE- und photoschaltbare Azobenzol-C-Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate synthetisiert und grundlegende Bedingungen der enzymatischen Reaktionen erarbeitet. Hierbei konnte der enzymatische Syntheseansatz erfolgreich in Lösung umgesetzt und der chemo-enzymatische Einbau aller synthetisierten Bausteine nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Methode in eigenständigen Arbeiten weiterverfolgt, um den multiplen Einbau NPE-modifizierter Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate in direkter Nachbarschaft sowie deren Einbau in DNA/RNA-Mixmere mit Phosphodiester- oder Phosphorthioatrückgrat zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Enzyme neben lichtaktivierbaren Modifikationen zusätzliche Anpassungen der Phosphateinheit sowie unterschiedliche Ribosebausteine in Kombination tolerieren. Da exogene RNA schnell von Exonukleasen abgebaut und somit unwirksam wird, werden zahlreiche stabilisierende Anpassungen an synthetischen RNAs vorgenommen. Zu den häufigsten zählen Phosphorthioate und Modifikationen der Ribose. Mit der erfolgreichen Modifikation der chimären Oligonukleotide eröffnet die erarbeitete Methode einen wichtigen Zugang zu therapeutisch interessanten Oligonukleotiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung biologisch relevanter Anwendungsmöglichkeiten konnte mit der Synthese, Charakterisierung und Umsetzung eines DEACM-geschützten Uridin-3‘,5‘-Bisphosphates (pUDEACMp) errungen werden. Im Vergleich zur verwendeten NPE-Schutzgruppe ist das Absorptionsspektrum der DEACM-Schutzgruppe bathochrom-verschoben, was eine Abspaltung mit Wellenlängen > 400 nm erlaubt. Dadurch können Zellschäden vermieden und Oligonukleotide mit NPE- und DEACM-Modifikation wellenlängenselektiv angesprochen werden...

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Genetic Code Expansion Facilitates Position‐Selective Modification of Nucleic Acids and Proteins

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In-Cell Structural Biology by NMR: The Benefits of the Atomic Scale

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Chemo-enzymatische Synthese lichtaktivierbarer RNA & Synthese lichtregulierbarer Oligonukleotide zur spektroskopischen Strukturaufklärung

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